一种诱变菌种以及微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法，将新月弯孢菌ATCC 13432的诱变菌种经培养后接种至转化培养基，对石胆酸进行发酵转化，得到熊去氧胆酸。本发明专利技术提供了一种新的以石胆酸为原料，通过生物发酵制备熊去氧胆酸的方法，该方法未使用动物源提取，绿色环保，成本低，工艺步骤简单，反应条件温和，反应收率高，试剂简单易得，适合工业化大规模生产。适合工业化大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种诱变菌种以及微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法


[0001]本专利技术涉及化学制药
，尤其涉及一种诱变菌种以及微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法。

技术介绍

[0002]熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid，简称UDCA)是传统名贵中药熊胆的主要有效成分，化学名称为3a,7β
‑
二羟基
‑
5β
‑
胆甾烷
‑
24
‑
酸，具有极强的促进脂肪和脂肪酸水解的作用，医学上用于增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇酯，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解，在临床上主要用于治疗各种肝胆疾病和消化道疾病，例如用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。
[0003]目前熊去氧胆酸的制备方法一般有如下几种，一是通过活熊胆汁提取获得，该方法由于来源有限或动物保护法限制而逐渐被淘汰；二是以动物胆酸类，例如猪胆酸、牛胆酸、鹅去氧胆酸等为原料通过合成的方法制备，这些方法存在原料来源有限，反应步骤长，产率低等问题；三是以雄甾烯二酮为原料的合成方法，Helvetica.Chimica Acta.1984.67(2)612报道了以雄甾烯二酮原料，经九步反应制备熊去氧胆酸，该方法虽属非动物胆酸的原料制备的方法，但其价格较贵，合成中引进侧链的难度大；四是通过酶法制备，中国专利CN109154016A报道了以石胆酸为底物，加入氧化性或还原性辅酶、醇脱氢酶、羟化酶进行反应制备熊去氧胆酸。在该反应中需要用到辅酶，辅酶价格昂贵，成本高，另外，该技术的羟化酶是从菌体分离得到，价格昂贵，仅适合实验阶段研究，工业化可行性不大。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种诱变菌种以及微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法，具有较高的反应收率。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供了一种微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法，将新月弯孢菌ATCC 13432的诱变菌种经培养后接种至转化培养基，对石胆酸进行发酵转化，得到熊去氧胆酸。
[0006]上述反应的方程式如下：
[0007][0008]本专利技术以石胆酸为底物，通过新月弯孢菌(Curvularia lunata)ATCC 13432的诱变菌种生物发酵的方法在石胆酸的7位上引入β构型羟基，经简单后处理后得到产率高、纯
度高的熊去氧胆酸，本方法成本低，工艺步骤简单，反应条件温和，反应收率高，试剂简单易得，适合工业化大规模生产。
[0009]本专利技术优选的，所述新月弯孢菌ATCC 13432的诱变菌种的诱变方法为：以新月弯孢菌ATCC 13432为出发菌种，经过斜面培养，收集孢子制备孢子悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行石胆酸发酵，检测熊去氧胆酸的产量，得到能产生熊去氧胆酸的目标诱变菌种。
[0010]上述新月弯孢菌ATCC 13432的来源为美国菌种保藏中心。
[0011]本专利技术优选的，所述发酵转化方法为：将新月弯孢菌ATCC 13432的诱变菌种经斜面培养、一级种子培养和二级种子培养后加入转化培养基中，经菌体预培养后开始转化，菌体接种量为1％～10％，温度为30～32℃，转速100～400rpm，空气流量0.1～0.4Nm3/h，压力0.01～0.1MPa，转化时间为24
‑
72h。
[0012]本专利技术优选的，所述斜面培养的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
[0013]本专利技术优选的，所述一级种子培养和二级种子培养的培养基配方为：玉米浆1～20g/L，葡萄糖10～50g/L，pH为6.0。
[0014]本专利技术优选的，所述转化培养基配方为：玉米浆1～10g/L，葡萄糖10～30g/L，磷酸氢二钠1～10g/L，调pH＝7.0；转化培养方法为菌体预培养后，加入2g/L石胆酸开始转化。
[0015]本专利技术优选的，所述发酵转化后，还包括：后处理；
[0016]所述后处理为：
[0017]升温至80℃灭活，降至常温后用液碱调pH至12，抽滤，合并滤液；滤液调pH至3.0，用二氯甲烷萃取，静置分层；下层二氯甲烷层过滤后，除去溶剂，加入水，搅拌析晶，分离得到固体，即熊去氧胆酸。
[0018]与现有技术相比，本专利技术提供了一种微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法，将新月弯孢菌ATCC 13432的诱变菌种经培养后接种至转化培养基，对石胆酸进行发酵转化，得到熊去氧胆酸。本专利技术提供了一种新的以石胆酸为原料，通过生物发酵制备熊去氧胆酸的方法，该方法未使用动物源提取，绿色环保，成本低，工艺步骤简单，反应条件温和，反应收率高，试剂简单易得，适合工业化大规模生产。
附图说明
[0019]图1为本专利技术制备的熊去氧胆酸的核磁碳谱图；
[0020]图2为本专利技术制备的熊去氧胆酸的核磁氢谱图。
具体实施方式
[0021]为了进一步说明本专利技术，下面结合实施例对本专利技术提供的诱变菌种以及微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法进行详细描述。
[0022]以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0023]本专利技术实施例所采用的原料及其他化学试剂皆为市售商品。
[0024]实施例1熊去氧胆酸的制备
[0025]1、菌种
[0026]原始出发菌株：Curvularia lunata ATCC 13432。
[0027]2、菌体诱变育种：
[0028]将Curvularia lunata ATCC 13432菌株孢子转接到PDA斜面培养基上，28℃培养5～7天，加入0.02％浓度吐温80水溶液将孢子洗下，并将孢子悬液转入带玻璃珠的摇瓶中，放入摇床，220rpm摇30分钟，将孢子打散，过滤，将孢子和残存的菌丝组织分离。将孢子悬液用无菌水进行稀释，调整孢子浓度为108个/mL，将三角烧瓶放在220rpm摇床萌发5～8个小时。取萌发的孢子悬液966微升到EP管中，加入34微升3％浓度的亚硝基胍(NTG)溶液加入到孢子悬液中，混匀。
[0029]NTG处理时间分别为10min,20min,30min,40min,50min,60min,处理完毕，5000rpm离心8分钟，沉淀用0.85％的无菌生理盐水洗涤三次，最终用无菌生理盐水定容到1毫升，震荡均匀，取100微升孢子悬液梯度稀释并涂布平板，将涂布好的平板放置在28℃的条件下培养7～10天，观察菌落生长情况，并记录菌落数量计算致死率。经过培养，得到上述不同时间的致死率分别为31.5％，45.2％，53.1％，68.3％,81.6％，96.2％，因此表明处理50分钟为最佳时间。
[0030]挑选诱变得到的菌落和原始出发菌株按下述3“转化工艺”进行培养并进行生物转化，评测诱变菌株的效果。经过大量的诱变后筛选试验，得到一株菌株，摇瓶投料量0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，将新月弯孢菌ATCC 13432的诱变菌种经培养后接种至转化培养基，对石胆酸进行发酵转化，得到熊去氧胆酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新月弯孢菌ATCC 13432的诱变菌种的诱变方法为：以新月弯孢菌ATCC 13432为出发菌种，经过斜面培养，收集孢子制备孢子悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行石胆酸发酵，检测熊去氧胆酸的产量，得到能产生熊去氧胆酸的目标诱变菌种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵转化方法为：将新月弯孢菌ATCC 13432的诱变菌种经斜面培养、一级种子培养和二级种子培养后加入转化培养基中，经菌体预培养后开始转化，菌体接种量为1％～10％，温度为30～32℃，转速100～400rpm，空气流量0.1～0.4Nm3/h，压力0.01～...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋红平，唐杰，李斌，郭志军，
申请(专利权)人：湖南醇康医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：