一种诱变菌种以及从植物甾醇制备胆酸类化合物的方法技术

本发明专利技术提供了一种从植物甾醇制备4

【技术实现步骤摘要】
一种诱变菌种以及从植物甾醇制备胆酸类化合物的方法


[0001]本专利技术涉及化学制药
，尤其涉及一种诱变菌种以及从植物甾醇制备胆酸类化合物的方法，具体涉及以植物甾醇为原料通过生物发酵与化学合成相结合的方式制备胆酸类化合物的方法。

技术介绍

[0002]胆汁酸是胆汁的重要成分，在脂肪代谢中起着重要作用。胆汁酸主要存在于肠肝循环系统并通过再循环起一定的保护作用。近年来，胆酸及其衍生物被发现了在治疗和预防疾病方面有较大作用，因为很多胆酸及其衍生物是法尼醇X受体激动剂，因此会参与调节法尼醇X受体介导的病症，比如肝脏、肺部、肾脏、心脏等疾病或者糖代谢、脂肪代谢、胰岛素代谢等生物过程。
[0003]目前胆汁酸主要从生物体提取分离出来，近年来，人们也通过合成研究，实现了胆汁酸之间的相互转变，比如从猪去氧胆酸合成石胆酸(LCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)和熊去氧胆酸(UDCA)，从胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和去氧胆酸等合成石胆酸，从鹅去氧胆酸合成7
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酮石胆酸(7
‑
KLCA)进一步合成熊去氧胆酸或者奥贝胆酸等，一方面由于提取的胆酸类化合物来源毕竟有限，另一方面从生物体提取的胆酸类化合物可能含有不可知的污染物，人们也开始研究以植物原料为来源合成胆酸类化合物，但始终由于技术原因还处于小规模研发阶段。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种诱变菌种以及从植物甾醇制备胆酸类化合物的方法，该方法反应条件温和，反应收率高，适合工业化大生产。<br/>[0005]为达到上述目的，本专利技术提供了一种分支杆菌Mycobacterium sp.NRRL B
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3805的诱变菌种，保藏编号为CCTCC M2020987。
[0006]该菌种由分支杆菌NRRL B
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3805为出发菌种，经诱变得到。
[0007]上述原始菌种的来源为美国农业研究菌种保藏中心。
[0008]本专利技术提供了用于生产4
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胆烯酸
‑3‑
酮的分支杆菌诱变菌种的诱变方法，包括以下步骤：
[0009]以分支杆菌NRRL B
‑
3805为出发菌种，经过斜面培养和二级种子培养，收集菌体制备菌悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行植物甾醇发酵，检测4
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胆烯酸
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酮的产量，得到能产生4
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胆烯酸
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酮的目标诱变菌种，并分离保存菌株。
[0010]本专利技术优选的，所述斜面培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L；葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L；琼脂粉20g/L,pH＝7.5。
[0011]本专利技术优选的，所述种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/
L；葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L，pH＝7.5。
[0012]本专利技术优选的，所述固体培养基的配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L，葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L；琼脂粉20g/L，pH＝7.5。
[0013]所述诱变处理的时间优选为30min。
[0014]本专利技术提供了上述保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种在制备4
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胆烯酸
‑3‑
酮、石胆酸、鹅去氧胆酸或7
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酮石胆酸中的应用。
[0015]具体的，所述4
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胆烯酸
‑3‑
酮由上述保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种发酵转化得到。
[0016]所述石胆酸由由上述保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种发酵转化，然后经加氢反应和还原反应制备得到。
[0017]本专利技术提供了上述保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种联合亚麻刺盘孢菌124菌种在制备鹅去氧胆酸或7
‑
酮石胆酸中的应用。
[0018]上述亚麻刺盘孢菌124菌种的保藏编号为Colletotrichum lini CBS 112.21。
[0019]具体的，所述鹅去氧胆酸由上述保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种、亚麻刺盘孢菌124菌种依次进行发酵转化，然后经加氢反应和还原反应制备得到。
[0020]所述7
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酮石胆酸由上述保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种、亚麻刺盘孢菌124菌种依次进行发酵转化，然后经加氢反应和还原反应制备得到鹅去氧胆酸，然后与N
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溴代丁二酰亚胺反应生成7
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酮石胆酸。
[0021]具体的，本专利技术提供了一种从植物甾醇制备4
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胆烯酸
‑3‑
酮的方法，将保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种经培养后接种至转化培养基，对式I所示植物甾醇进行发酵转化，得到式Ⅱ所示4
‑
胆烯酸
‑3‑
酮；
[0022][0023]其中，R为
‑
(CH2)3CH(C2H5)CH(CH3)2、
‑
CH2CH＝CHCH(C2H5)CH(CH3)2、
‑
(CH2)3CH(CH3)CH(CH3)2或
‑
CH2CH＝CHCH(CH3)CH(CH3)2。
[0024]其反应路线如下所示：
[0025][0026]本专利技术以植物甾醇为原料，通过生物发酵与化学合成相结合的手段，制备4
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胆烯酸
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酮、石胆酸(LCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、7
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酮石胆酸(7
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KLCA)、等一系列胆酸类化合物。
[0027]植物甾醇是具有甾体环戊烷多氢菲的骨架结构，侧链可以是不同的烷烃取代基团，是一种由多个类似物组成的混合物，常见的有豆甾醇、木甾醇、β
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谷甾醇、菜油甾醇等。植物甾醇广泛存在于植物的根茎叶及果实中，在大自然中储量惊人，其资源储量比皂素更加的丰富，并且现代商业产品的生产中的废渣都含有高含量的植物甾醇，如油脂产业中压榨后的残渣或馏出物，制糖业中的甜菜渣和甘蔗渣，还有造纸的废液废水中均含有一定量的植物甾醇，如果对这些甾醇进行开发利用，不仅解决了原料来源问题，更是解决了废水废渣的环保问题。
[0028]本专利技术提供的合成方法中涉及加氢还原、水解、酯化等常规反应，反应试剂简单易得，反应条件温和，反应收率高，适本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分支杆菌Mycobacterium sp.NRRL B
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3805的诱变菌种，保藏编号为CCTCC M2020987。2.一种用于生产4
‑
胆烯酸
‑3‑
酮的分支杆菌的诱变方法，包括以下步骤：以分支杆菌NRRL B
‑
3805为出发菌种，经过斜面培养和二级种子培养，收集菌体制备菌悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行植物甾醇发酵，检测4
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胆烯酸
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酮的产量，得到能产生4
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胆烯酸
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酮的目标诱变菌种，并分离保存菌株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述斜面培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，葡萄糖15～30g/L,硝酸钠2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～1g/L，琼脂粉20g/L，pH＝7.5；所述种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，葡萄糖15～30g/L,硝酸钠2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～1g/L，pH＝7.5；所述固体培养基的配方为：酵母膏粉10～20g/L，葡萄糖15～30g/L,硝酸钠2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～1g/L，pH＝7.5，琼脂粉20g/L，pH＝7.5；所述诱变处理的时间为30min。4.权利要求1所述的保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种在制备4
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胆烯酸
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酮、石胆酸、鹅去氧胆酸或7
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酮石胆酸中的应用。5.一种从植物甾醇制备4
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胆烯酸
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酮的方法，其特征在于，将权利要求1所述的保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种经培养后接种至转化培养基，对式Ⅰ所示植物甾醇进行发酵转化，得到式Ⅱ所示4
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胆烯酸
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酮；其中，R为
‑
(CH2)3CH(C2H5)CH(CH3)2、
‑
CH2CH＝CHCH(C2H5)CH(CH3)2、
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(CH2)3CH(CH3)CH(CH3)2或
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CH2CH＝CHCH(CH3)CH(CH3)2。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵转化方法为：将权利要求1所述的保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种经一级种子培养和二级种子培养后加入转化培养基中，接种量1％～30％，温度20
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30℃，转速200～500rpm，空气流量0.1～0.5Nm3/h，压力0.01～0.1MPa，转化时间为96～144h。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一级种子培养和二级种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，葡萄糖15～30g/L,硝酸钠2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～1g/L，pH＝7.5；所述转化培养基配方为：植物甾醇10～40g/L，大豆油80～200g/L，玉米浆10～100g/L，硝酸钠2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～1g/L，调pH＝8.0。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵转化后，进行后处理，得到式Ⅱ所示4
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胆烯酸
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酮；
所述后处理具体为：调节体系pH值为5.0
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6.0，加热搅拌后，静止分层；取油层用甲醇进行提取，浓缩除去溶剂后，用乙酸乙酯回流打浆，冷却析出固体后过滤；滤液浓缩除去溶剂，用氯仿和水，在pH12
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13的条件下，常温搅拌、静置分层；取水相调节pH至1.0，静置分层；取分层后得到的油状物，为式Ⅱ所示4
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胆烯酸
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酮。9.一种从植物甾醇制备石胆酸的方法，包括以下步骤：A)将权利要求1所述的保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种经培养后接种至转化培养基，对式Ⅰ所示植物甾醇进行发酵转...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋红平，唐杰，李斌，郭志军，
申请(专利权)人：湖南醇康医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：