一种甾体中间体的生物转化制备方法技术

本发明专利技术涉及一种甾体中间体的生物转化制备方法，属于生物制药技术领域。本发明专利技术先制备中间体I的甾体混悬液，然后将混悬液投入含有霉菌种子的发酵培养基中，在霉菌的作用下发生C

A biotransformation method for steroidal intermediates

【技术实现步骤摘要】
一种甾体中间体的生物转化制备方法
本专利技术属于生物制药
，特别涉及一种甾体中间体的生物转化制备方法。
技术介绍
甾体激素类物质是皮质激素药物的主要成分，倍他米松以及地塞米松等都是甾体激素类物质，具有抗炎、抗感染、抗休克和抑制免疫等药理作用。甾体的C11位α-羟化是各种皮质激素合成不可缺少的步骤。与化学合成方法相比较，生物转化具有转化效率高、专一性好等突出优点，所以目前甾体的C11位α-羟化通常由微生物通过发酵过程来完成。微生物催化羟化反应的酶为胞内酶，甾体底物晶体必须先分散并逐渐溶于水中，然后被微生物吸收并在细胞内经酶催化转化，最后产物排出细胞外并形成新的晶体，完成整个转化过程。可见，要提高投料浓度和转化率，必须同时满足两个条件，首先是物料在发酵液和微生物细胞之间的迁移速度要快，其次是微生物细胞内的酶能够保持较长时间的高活性状态。由于甾体中间体通常亲水性较差，在对甾体的C11位进行α-羟化的反应中，现有技术以水溶性有机溶媒溶解底物，然后投入到发酵液中，底物在形成极细微晶的同时借助于有机溶媒的助溶作用，使其向微生物细胞内部迁移的速度得到提升，进而提高了转化效率。常用于甾体的C11位α-羟化发酵的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇等，这些溶剂的使用虽然会在一定程度上提高转化效率，但有机溶剂本身对微生物是有毒害的，长时间和有机溶剂接触会让微生物细胞迅速老化，失去对底物的转化能力，这就意味着有机溶剂使用量是有限的，该工艺的投料浓度提升自然就会遇到瓶颈。同时，有机溶剂的使用也会带来严重的安全和环保问题，在对安全和环保要求越来越严格的现在，并不利于转化方法的产业化推广。公开号为CN103146793B的中国专利报导了一种添加生物催化剂的C11位α-羟化生物转化方法，但仍然采用了乙醇溶解底物的方式投料，转化过程中底物最高浓度仅达到8g/L，生物转化率最高仅为80％。
技术实现思路
本专利技术提供了甾体中间体的生物转化制备方法，能够解决上述现有技术问题中的一种或几种。本专利技术针对现有C11位α-羟化反应生产技术的制约因素，重点研究了如何增加底物溶解性以及延长羟化酶活性的方法。初步研究发现，将甾体底物中间体I与一定量的乳化剂混合后充分乳化，可取代有机溶剂溶解甾体底物的方式实现C11位α-羟化，在投料浓度相同的情况下，可得到不低于现有技术方案的生物转化率。进一步开展的实验表明，在甾体乳化后，如果在投料时同步加入一定量的氮源物质，甾体的生物转化率会有一定的提升。最终的研究发现，最佳的技术方案是：将氮源物质与表面活性剂混合后加入中间体I进行乳化，再投入含有霉菌种子的发酵培养基中发酵，甾体的生物转化率有大幅度的提高。在投料浓度提高到15g/L的情况下，C11位α-羟化反应的生物转化率达到90％以上。根据本专利技术的一个方面，提供了一种甾体中间体的生物转化制备方法，先制备中间体I(倍他米松脱溴物或地塞米松脱溴物)的甾体混悬液，然后将其投入霉菌预培养液中，中间体I在发酵培养基中的初始浓度可以达到15g/L以上。在霉菌的作用下中间体I发生C11位羟化反应，同时水解C21位醋酸酯，得到中间体Ⅱ(倍他米松羟化物或地塞米松羟化物)，中间体Ⅱ为生产地塞米松或者倍他米松的重要中间体，主要反应为：生物发酵过程中使用的霉菌为金龟子绿僵菌、匍枝根霉、赭曲霉中的一种或几种。具体步骤如下：(1)菌种培养制备霉菌斜面菌种，并将所得斜面培养物接入种子培养基，培养得霉菌种子液；将种子液转接入发酵培养基进行发酵预培养，得到预培养液；备用。(2)制备甾体混悬液制备表面活性剂与第一氮源物质的混合水溶液，并将混合水溶液灭菌，然后加入中间体I，充分搅拌乳化后得甾体混悬液，备用。(3)生物转化将步骤(2)中得到的甾体混悬液转入步骤(1)中的预培养液，得初始发酵液，继续发酵培养。(4)后处理生物转化结束后，将最终培养液灭活后冷却至室温，用有机溶剂进行萃取，萃取液浓缩得到产物中间体Ⅱ。在一些实施方式中，为适应较大规模的生产，种子液可以分为摇瓶种子液、一级种子液和二级种子液。即通过斜面菌种先得到摇瓶种子液；再将摇瓶种子液接入更大体积的种子培养基中，经培养得到一级种子液；一级种子液按比例接入更大体积的种子培养基中，培养后得到二级种子液，用于发酵接种。在一些实施方式中，摇瓶种子液接种一级种子培养基接种量为1％～5％；一级种子液接种二级种子培养基接种量为1％～10％；二级种子液接种发酵培养基接种量为5％～15％。在一些实施方式中，可以省略一级种子液和二级种子液，而是用摇瓶种子液直接接种发酵，接种量为5％～15％。在一些实施方式中，可以省略二级种子液，而是由一级种子液接种发酵，接种量为5％～15％。在一些实施方式中，种子培养基配比：第二氮源物质为10～15g/L、葡萄糖为10～15g/L、KH2PO4为1～3g/L、KNO3为0.5～1g/L；发酵培养基配比：第二氮源物质为20～45g/L、葡萄糖为20～40g/L、KH2PO4为1～3g/L、MgSO4为0.5～1.5g/L。在一些实施方式中，种子培养基和发酵培养基中的第二氮源物质可以是酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏、硫酸铵、磷酸氢二铵中的一种或几种。在一些实施方式中，甾体混悬液的制备方法为：在投料罐中加入表面活性剂以及第一氮源物质，加水溶解，并将混合水溶液灭菌。将投料罐内物料灭菌后冷却至29℃以下，加入一定数量的中间体I，搅拌至少1小时使之充分乳化，得甾体混悬液。在一些实施方式中，制备甾体混悬液过程中，使用的第一氮源物质包含酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏中的一种或几种。第一氮源物质在发酵液中的浓度为2～5g/L，在发酵过程中起补充氮源作用。在一些实施方式中，制备甾体混悬液过程中，使用的表面活性剂包含吐温-80、司盘-80、吐温-40、吐温-20、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种，表面活性剂在发酵液中的初始浓度为0.5～1.0g/L，在甾体混悬液制备过程中起乳化分散作用。在一些实施方式中，将制备好的甾体混悬液转入预培养液，得到初始发酵液，其中表面活性剂的初始浓度为0.5～1.0g/L，中间体I的初始浓度为15g/L以上，氮源物质的浓度增加2～5g/L。在一些实施方式中，步骤(1)中发酵预培养，控制培养温度25～32℃，通气量0.025～0.75vvm，预培养8～12小时。由此，菌体在进行生物转化之前进行充分的繁殖，霉菌生物量大幅提高，有助于生物转化的进行。在一些实施方式中，步骤(3)生物转化，控制温度25～32℃，通气量0.025～0.75vvm，转化周期为70～76小时。在一些实施方式中，后处理方式为：发酵转化结束后，将最终培养液灭活并冷却至室温，用有机溶剂进行萃取，萃取有机溶剂为醋酸乙酯、醋酸丁酯、三氯甲烷、二氯甲烷、二氯乙烷、己烷、庚烷中的一种或几种。可选用的有机溶剂较多，并且不会影响产物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，先制备中间体I的甾体混悬液，然后投入含有霉菌种子的发酵培养基中，所述中间体I在霉菌的作用下发生C

【技术特征摘要】
20190806 CN 20191072005481.一种甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，先制备中间体I的甾体混悬液，然后投入含有霉菌种子的发酵培养基中，所述中间体I在霉菌的作用下发生C11位羟化反应，并同时水解C21位醋酸酯，得到中间体Ⅱ。


2.根据权利要求1所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，所述中间体I的甾体混悬液制备过程为：
(1)将第一氮源物质和表面活性剂溶于适量水中，加热灭菌；
(2)投入中间体I，搅拌，使之乳化，得到中间体I的甾体混悬液。


3.根据权利要求2所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，步骤(1)所述第一氮源物质包含酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏中的一种或几种；所述第一氮源物质在发酵液中的浓度为2～5g/L。


4.根据权利要求2所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，步骤(1)所述表面活性剂包含吐温-80、司盘-80、吐温-40、吐温-20、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种，所述表面活性剂在发酵液中的初始浓度为0.5～1.0g/L。

【专利技术属性】
技术研发人员：杜艳，刘辉，杜江涛，王鹏辉，单东奇，白傲雪，刘娟玲，
申请(专利权)人：江苏远大仙乐药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32