一种检测堆肥中酚类物质的传感器及其检测方法技术

本发明专利技术涉及堆肥系统中酚含量的生物传感器检测。本发明专利技术以修饰了漆酶－Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］磁性纳米颗粒的碳糊电极为工作电极，在三电极的电解池中测定堆肥浸出液中响应电流变化，用建立的对苯二酚、邻苯二酚与电流变化的线性回归方程，计算出堆肥浸出液中酚的含量；本发明专利技术酚含量与电流变化呈线性关系的范围是对苯二酚为１×１０↑［－７］～１．３７５×１０↑［－４］Ｍ，邻苯二酚为５×１０↑［－８］～２．７５×１０↑［－４］Ｍ。应用本发明专利技术测定堆肥中的酚含量不仅比高效液相色谱法操作快速、简便、灵敏，而且还能克服分光光度法在复杂系统测定中浊度和光干扰物质的干扰问题，可以成为城市生活垃圾堆肥控制系统中一套快速、低成本的酚含量检测技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酚含量的检测方法，具体涉及堆肥复杂系统中酚类物质的生物传感器测定。
技术介绍
酚类物质是大规模有机化工工业非常重要的基本原料和副产物，在环境中广泛存在，难以被生物或非生物降解，具有高毒性。作为公认的有害物质，酚对人体健康和环境有很大的影响。在城市生活垃圾堆肥系统中，存在有多种酚类污染物，堆肥中自然微生物菌群分泌出的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和多酚氧化酶等多种酶均可以催化酚类物质的解毒和氧化。因此，对堆肥过程中的酚类物质的检测，可实施对环境污染物的监测控制。目前，对于酚含量的测定采用较多的有分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法等方法进行检测。用分光光度法检测，由于对底物浊度的要求和光干扰物质的影响，限制了其精确性和使用范围；采用液相和气相色谱法检测，检测前需要对样品分离，分离过程通常需要预处理，比较繁琐和耗时，此外检测仪器比较昂贵，且不便携带，不能进行实时检测。因此研究一种适合在堆肥过程控制中的酚含量测定是亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术旨在运用电化学原理，提供一种测定酚含量的电流型生物传感器，以提高酚类物质测定的灵敏性和抗干扰能力，以便更好地应用到城市生活垃圾堆肥处理中，解决堆肥过程控制系统中的实时在线监测问题。本专利技术是通过以下技术方案实现上述专利技术目的。一种检测堆肥中酚类物质的传感器，是在距碳糊电极表面8mm处的碳糊1中埋入磁体2，电极经抛光、清洗后，取足量的漆酶—磁性纳米颗粒交联体3滴涂在电极表面，用磷酸盐缓冲溶液冲洗掉未吸附的交联体后制成漆酶传感器。漆酶—磁性纳米颗粒交联体3是在制备Fe3O4胶状沉淀后加入正硅酸乙酯和氨丙基三甲氧基硅烷完成氨基硅烷化，再悬浮于戊二醛中搅拌制得醛基化核/壳型磁性纳米颗粒，然后将漆酶和磁性纳米颗粒按1∶50的质量比加入到pH7.0、1/15M的磷酸盐缓冲溶液中搅拌12小时，再用磷酸盐缓冲溶液清洗若干次抽滤干燥即成。传感器检测堆肥中酚类物质的方法是在接有三电极系统的电解池中，以饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，以修饰了漆酶-Fe3O4磁性纳米颗粒交联体的碳糊电极为工作电极，用计时电流法测定，先用1/15M的磷酸盐缓冲溶液调节含酚的堆肥浸出液的pH值至5.5，测出传感器在还原电位-0.232V下的响应电流变化，按照对苯二酚和邻苯二酚含量与电流变化建立的线性回归方程计算堆肥浸出液中酚含量，对苯二酚含量与电流变化的线性回归方程为y＝(0.2118±0.0045)x+(0.9834±0.2496)y是电流变化的值(μA)，x是加入对苯二酚浓度(μM)。对苯二酚的线性范围为1×10-7～1.375×10-4M，检测下限达到3×10-10M，r2为0.9933。邻苯二酚含量与电流变化的线性回归方程为y＝(0.1581±0.0025)x+(0.7702±0.2764)y是电流变化的值(μA)，x是加入邻苯二酚浓度(μM)。邻苯二酚的线性范围为5×10-8～2.75×10-4M，检测下限达到5×10-8M，r2为0.9953。下面结合附图进一步详述本专利技术附图说明图1以漆酶—磁性纳米颗粒交联体修饰的碳糊电极结构；1、碳糊 2、磁体3、漆酶—磁性纳米颗粒交联体 4、PVC管5、推进塞6、电线图2漆酶氧化还原酚的机制；其中QH2代表酚，Qox代表酚的氧化产物；图3用计时电流法测定堆肥浸出液中加入对苯二酚的阶梯电流响应；图4对苯二酚含量与电流变化的线性回归图；图5邻苯二酚含量与电流变化的线性回归图；漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是含有铜离子的多酚氧化酶，每个漆酶蛋白分子中含有四个铜离子，包括一个I型铜原子，是单电子受体，和氨基酸残基结合成为单核中心，一个II型铜原子，也是单电子受体，与两个III型铜原子构成三核中心；两个III型铜原子是双电子受体，形成偶合的离子对。铜离子是漆酶的催化活性中心，是漆酶表现催化活性的决定因素。漆酶是单电子氧化还原酶，可催化氧化250多种底物，其中酚及其衍生物占总数的一半以上，随着酚类底物取代基的种类、数目和在芳环上的位置不同，漆酶的催化活性也有差异。催化氧化反应主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同作用。在漆酶催化酚类底物反应中，酚将电子转移给I型铜原子，通过氨基酸配体将电子传递给三核位点，还原态的酶分子再通过四电子转移传递给O2，失去电子的酚变成醌自由基，再通过自由基反应形成氧化产物，O2则还原为水。整个反应过程需要连续的单电子氧化作用来满足漆酶的充分还原。漆酶主要由一些高等植物如漆树以及白腐菌等真菌分泌产生，有些细菌也能产生漆酶。在堆肥系统中，也存在许多能够分泌出漆酶的优势菌种，如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、简青霉(Penicillium simplicissimum)等。漆酶是胞外酶，对底物的氧化具有非特异性的特点，具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，可以催化空气中的氧气直接氧化分解酚类、芳胺类和羧酸类等化合物以及它们的衍生物，此外还有甾体激素、生物色素、金属有机物以及一些非酚类化合物。因此，利用漆酶对酚类物质的催化作用可以制备出灵敏稳定的酚传感器，实现对堆肥系统中酚类物质的实时在线测定。在制备漆酶和磁性纳米颗粒交联体的过程中，首先采用化学共沉淀的方法制备Fe3O4胶体，其粒径为10nm左右。然后用正硅酸乙酯和聚乙二醇等试剂在Fe3O4表面包被一层SiO2壳，形成核/壳型的磁性纳米粒子，其形状为球形，粒径在120nm左右。再用氨丙基三甲氧基硅烷将纳米粒子表面氨基硅烷化，接着用戊二醛与粒子表面的氨基反应，形成席夫碱结构，从而使漆酶交联固定在磁性粒子表面。磁性纳米粒子比表面积很大，吸附酶量比较高，并使固定化的酶在溶液中与底物充分接触反应，电化学响应非常灵敏。在PVC管中填充碳糊，并埋入高能钕铁硼磁钢，该种磁体具有磁力大，体积小等特点。制成带磁性的碳糊电极后，取足量的漆酶和Fe3O4磁性纳米颗粒交联体滴涂在电极表面，形成磁性吸附，从而制备出漆酶传感器，其构造见图1。将漆酶与Fe3O4磁性纳米颗粒交联，达到固定化酶的效果，增强酶的稳定性，延长酶电极使用寿命，20天内，响应电流基本保持不变；40天左右，降到初始响应电流的70％。利用顺磁性，将漆酶—磁性纳米颗粒吸附到碳糊电极表面上，便于分离和再生，而且操作简单。当酶传感器的响应信号显著降低时，可以通过更新电极表面，重新吸附具有活性的漆酶和Fe3O4磁性纳米颗粒交联体达到再生的目的。即将电极的后端的推进塞往前推进，挤出失活的漆酶-磁性颗粒交联体和碳糊的混合层，用0.5μm Al2O3粉末进行抛光至电极表面光洁，形成新的电极表面，然后用水冲洗电极表面，再依次用38％HNO3、丙酮、水在超声波中清洗，最后再用磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)冲洗，自然晾干备用。经重新处理的电极吸附具有活性的漆酶和Fe3O4磁性纳米颗粒交联体，完成再生。也可以使用装有蒸馏水的洗瓶吹洗传感器表面，将磁场吸附的颗粒吹洗干净，自然晾干后再重新吸附具有活性的漆酶和Fe3O4磁性纳米颗粒交联体达到再生的目的。后一种方法更简便易行。酚类物质在传感器表面的氧化还原机制见图2，漆酶以O2和酚为底物，将酚催化氧化。酚的氧化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测堆肥中酚类物质的传感器，其特征在于在距碳糊电极表面８ｍｍ处的碳糊（１）中埋入磁体（２），电极经抛光、清洗后，取足量的漆酶－磁性纳米颗粒交联体（３）滴涂在电极表面，用磷酸盐缓冲溶液冲洗掉未吸附的交联体后制成漆酶传感器。

【技术特征摘要】
1.一种检测堆肥中酚类物质的传感器，其特征在于在距碳糊电极表面8mm处的碳糊(1)中埋入磁体(2)，电极经抛光、清洗后，取足量的漆酶-磁性纳米颗粒交联体(3)滴涂在电极表面，用磷酸盐缓冲溶液冲洗掉未吸附的交联体后制成漆酶传感器。2.根据权利要求1所述的检测堆肥中酚类物质的传感器，漆酶-磁性纳米颗粒交联体(3)是在制备Fe3O4胶状沉淀后加入正硅酸乙酯和氨丙基三甲氧基硅烷完成氨基硅烷化，再悬浮于戊二醛中搅拌制得醛基化核/壳型磁性纳米颗粒，其特征在于将漆酶和Fe3O4磁性纳米颗粒按1∶50的质量比加入到pH7.0、1/15M的磷酸盐缓冲溶液中搅拌12小时，再用磷酸盐缓冲溶液清洗若干次，抽滤干燥即成。3.一种如权利要求1所述的传感器检测堆肥中酚类物质的方法是在接有三电极系统的电解池中，以饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，以修饰了漆酶-Fe3O4磁性纳米颗粒交联体的碳糊...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾光明，汤琳，章毅，牛承岗，沈国励，黄丹莲，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]