D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法技术

本发明专利技术公开了D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过在DSDPEase基因N端融合SAPs，筛选出热稳定性提高的SAPs‑DSDPEase重组菌株。为提高重复利用性，本发明专利技术通过添加适当比例的二氧化钛与海藻酸钠形成混合固定化载体，制备固定化细胞。重组菌株B.subtilis168/pMA5‑SAP1‑DSDPEase40℃孵育48h后残余酶活为58％。按照优化后的条件制备的固定化细胞连续操作10次，固定化小球机械强度依然维持在80％，残余酶活回收率保留58％。利用固定化细胞合成D‑阿洛酮糖，催化反应80min，D‑阿洛酮糖产量可达153.3g/L，转化率为30.4％。

【技术实现步骤摘要】
D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法
本专利技术涉及D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法，属于生物

技术介绍
D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的己酮糖单糖，其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖的0.3％，具有与蔗糖相近的口感及容积特性，同样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应可作为食品中蔗糖理想的替代品。毒理学实验证实，D-阿洛酮糖的半数致死量(LD50)为16.3g/kg，相比果糖的LD50为14.7g/kg，赤藻糖醇的LD50为15.3g/kg，根据毒性评级，D-阿洛酮糖属于“相对无害”类别(毒性评级最低)。2014年，美国食品药品监督管理局(U.S.FoodandDrugAdministration，FDA)正式批准D-阿洛酮糖为一般公认安全(GenerallyRecognizedasSafe，GRAS)，允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。D-阿洛酮糖具有多种保健作用，可抗高血糖症，预防或治疗肥胖及因肥胖引起的炎症，有利地调节胆固醇代谢，通过调节肠道微生物群发挥其生物学效应。在最大剂量2000mg/kg时，D-阿洛酮糖对大鼠的生殖毒性无不良影响。D-阿洛酮糖天然存在于一些水果中，含量极低，化学方法合成D-阿洛酮糖步骤繁琐且效率低，经济便捷的生物法合成D-阿洛酮糖成为研究热点。日本香川大学izumori团队利用一株产碱菌首次实现生物法合成D-阿洛酮糖，并通过固定化酶异构化D-果糖合成D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖3-差向异构酶为胞内酶，获得纯酶需浓缩、破细胞、纯化等步骤，工业生产选择全细胞催化较为经济快捷。全细胞生物催化，要求宿主细胞是不分泌内毒素、外毒素、异味物质的GRAS菌株，枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌的模式生物是宿主细胞的最佳选择。游离的全细胞在催化反应结束后，收集困难并且在重复使用的过程中会造成细胞破损。为解决游离细胞的生产弊端，固定化细胞技术应运而生，固定化细胞制备方法包括吸附法、包埋法、共价法和交联法四种，固定化材料要求无生物毒性，性质稳定，廉价耐用。
技术实现思路
本专利技术通过在D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DSDPEase)基因N端融合双亲短肽(SAPs)，筛选出热稳定性提高的SAPs-DSDPEase枯草芽孢杆菌重组菌株。为提高重复利用性，本专利技术通过添加适当比例的二氧化钛与海藻酸钠形成混合固定化载体，制备SAPs-DSDPEase枯草芽孢杆菌重组菌株固定化细胞。本专利技术的目的是提供一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖异构酶的改造方法和一种简单有效的制备重组DSDPEase固定化细胞的方法，所制备的固定化细胞的应用，从而解决了现有的技术中存在的困难。本专利技术的第一个目的是提供一种表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，所述重组菌表达N端融合双亲短肽的D-阿洛酮糖异构酶基因。在一种实施方式中，所述N端融合双亲短肽的D-阿洛酮糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。在一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168为宿主，以pMA5为表达载体。本专利技术的第二个目的是提供一种提高D-阿洛酮3-差向异构酶热稳定性的方法，所述方法为在D-阿洛酮糖异构酶基因N段融合双亲短肽。在一种实施方式中，所述双亲短肽的核苷酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。本专利技术的第三个目的是提供一种固定化细胞，所述固定化细胞包埋有上述重组菌。本专利技术的第四个目的是提供一种固定化细胞的制备方法，所述方法步骤如下：1)将重组菌在TB培养基中200-220rpm，35-38℃，培养20-28h，获得发酵液，将发酵液离心收集细胞；2)用生理盐水悬浮细胞并加入海藻酸钠溶液和二氧化钛，充分搅拌获得混合物；3)使用针头式注射器以0.5-1.5d/s的速度将混合物滴入CaCl2溶液中成型，并在4℃硬化得到微球；4)将硬化后的微球弃去上清，用生理盐水洗涤3次，真空抽滤去除水分，即得到固定化细胞；5)将固定化细胞置于戊二醛溶液中交联。在一种实施方式中，所述海藻酸钠溶液浓度为1.5-2％。在一种实施方式中，所述细胞的终浓度为60-70g/L。在一种实施方式中，所述二氧化钛是海藻酸钠质量的1/2～1/4。在一种实施方式中，所述CaCl2溶液浓度为2％。在一种实施方式中，所述戊二醛溶液浓度为0.01～0.04％。本专利技术的第五个目的是提供一种固定化细胞生产D-阿洛酮糖的方法。在一种实施方式中，所述方法为在发酵罐中，加入溶于pH6-8.5磷酸盐缓冲液的D-果糖溶液，加入固定化细胞，转速180-220转/分，转化温度45-55℃，反应50-100min。本专利技术的第六个目的是所述重组菌或固定化细胞在制备D-阿洛酮糖或制备含有D-阿洛酮糖的食品、膳食补充剂或医药制剂的应用。有益效果：将DSDPEase、SAP1-DSDPEase、SAP2-DSDPEase、SAP3-DSDPEase纯酶置于40℃水浴锅孵育48h，每隔6h取出100μL，检测残余酶活。SAP1-DSDPEase表现出比DSDPEse更稳定的残余酶活为58％。按照优化后的条件制备的固定化细胞连续操作10次，固定化小球机械强度依然维持在80％，残余酶活回收率保留58％。利用固定化细胞5L发酵罐转化D-果糖合成D-阿洛酮糖，催化反应80min，D-阿洛酮糖浓度可达153.3g/L，转化率为30.7％。附图说明1、图1SAPs-DSDPEaseSDS-PAGE分析。泳道1：对照；泳道2：B.subtilis/pMA5-DSDPEase破细胞上清液；泳道3：SAP1-DSDPEase纯酶；泳道4：SAP2-DSDPEase纯酶；泳道5：SAP3-DSDPEase纯酶。具体实施方式实施例1构建枯草芽孢杆菌重组菌株SAPs-DSDPEase质粒pMA5被快速限制性内切酶BamHⅠ、MluI线性化并进行琼脂糖凝胶电泳，将琼脂凝胶回收后，得到纯净的pMA5线性化质粒。使用引物DSDPE-F和R-pMA5-DS(MluI-6×His)，以核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的DSDPEase基因为模板，PCR克隆纯化后得到PCR产物DSDPEase-6×His。以上述PCR产物作为模板，使用引物R-pMA5-DS(MluI-6×His)和长引物pMA5(BamHI)-SAP1-F或pMA5(BamHI)-SAP3-F或pMA5(BamHI)-SAP3-F引入不同的SAPs序列，分别得到SAP1-DSDPEase-6×His、SAP2-DSDPEase-6×His和SAP3-DSDPEase-6×His基因片段。将上述获得的DSDPEase-6×His、SAP1-DSDPEase-6×His、SAP2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的N端融合双亲短肽的D-阿洛酮糖异构酶基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的N端融合双亲短肽的D-阿洛酮糖异构酶基因。


2.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168为宿主，以pMA5为表达载体。


3.一种固定化细胞，其特征在于，包埋有权利要求1或2所述重组菌。


4.一种固定化细胞的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)将权利要求1或2所述重组菌在培养基中培养获得发酵液，并离心收集细胞；2)将细胞重悬并加入海藻酸钠溶液和二氧化钛，获得混合物；3)以0.5-1.5d/s的速度将混合物滴入CaCl2溶液中，硬化得到微球；4)用生理盐水洗涤微球并去除水分，得到固定化细胞；5)将制备好的固定化细胞置于戊二醛溶液中交联。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，魏玉霞，张显，胡孟凯，杨套伟，徐美娟，邵明龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32