一种改造基因BBD29_14900的重组菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种对棒杆菌中BBD29_14900基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高谷氨酸的发酵产量。所述点突变是使BBD29_14900基因序列第1114位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，使编码的相应氨基酸序列第372位天冬氨酸被天冬酰胺取代。

【技术实现步骤摘要】
一种改造基因BBD29_14900的重组菌株及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种产L-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
众所周知，日常所用调味料味精就是L-谷氨酸单钠盐。自1909年日本专利技术并工业化生产味精以来，几经变迁，已发展成为以谷氨酸发酵为主题的世界性氨基酸发酵工业。生产味精谷氨酸之类氨基酸的发酵，区别于传统的酿酒和抗菌素发酵，是一种改变微生物代谢的代谢控制发酵。目前，厂家用葡萄糖发酵所使用的菌种主要为一些突变株，所述生产菌种主要是通过诱变为主的微生物育种而获得。但如果在现有产酸能力下，继续采用经典微生物育种技术，例如诱变、细胞融合等手段，以期达到大幅度提高产酸率和糖酸转化率已相当困难。因此，采用现代基因工程手段改造菌种，从而提高产酸率和糖酸转化率，不失为目前最有效的方法。因此利用基因工程手段改造生产菌种，谷氨酸的产酸率和糖酸转化率将会有较大的突破。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发用于改善细菌的L-谷氨酸生产能力的新技术，从而提供一种有效生产L-谷氨酸的方法。为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人通过研究发现，基因BBD29_14900或其同源基因，可以通过修饰所述基因或改善其表达，能够得到具有增强的L-谷氨酸生产能力的细菌。基于这些发现，完成了本专利技术。本专利技术提供了生成L-谷氨酸的细菌，其中编码SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的表达改善。本专利技术还提供了通过使用所述微生物生产L-谷氨酸的方法。本专利技术的第一个方面提供了生成L-谷氨酸的细菌，其具有编码SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的改善的表达。根据本专利技术，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。所述SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列是基因BBD29_14900或其同源基因编码的蛋白。所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-谷氨酸生产能力。在本专利技术中，术语“具有L-谷氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-谷氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-谷氨酸的细菌。具有L-谷氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-谷氨酸的细菌。术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。具有L-谷氨酸生产能力的细菌可以是能够在培养基中以优选0.5g/L以上，更优选1.0g/L以上的量积累目标L-谷氨酸的细菌。在本专利技术中，除非另有说明，术语“L-谷氨酸”是指游离形式的L-谷氨酸、其盐或其混合物。所述多核苷酸可以编码与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，突变前的所述多核苷酸可以包含SEQIDNO:1的核苷酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQIDNO:3的氨基酸序列的第372位天冬氨酸(D)被不同的氨基酸所取代。根据本专利技术，优选第372位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。根据本专利技术，SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，其中第372位天冬氨酸被天冬酰胺所取代后的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第1114位碱基发生突变而形成的。根据本专利技术，所述突变包括SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第1114位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸(BBD29_14900基因)的启动子。如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本专利技术中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生成L-谷氨酸的细菌，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的改善的表达；/n优选，所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。/n

【技术特征摘要】
1.一种生成L-谷氨酸的细菌，其特征在于，具有编码SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的改善的表达；
优选，所述改善的表达是编码SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。


2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQIDNO:3的氨基酸序列的第372位天冬氨酸被不同的氨基酸所取代；优选第372位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。


3.如权利要求1-2任一项所述的细菌，其特征在于，编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列。


4.如权利要求1-3任一项所述的细菌，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第1114位碱基发生突变而形成的；
优选，所述突变包括SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第1114位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；
优选，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。


5.如权利要求1-4任一项所述的细菌，其特征在于，所述细菌是棒杆菌属细菌，优选嗜乙酰棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacteriumcallunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutami...

【专利技术属性】
技术研发人员：马风勇，魏爱英，孟刚，赵春光，贾慧萍，苏厚波，杨立鹏，郭小炜，田斌，周晓群，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64