一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种L‑高丝氨酸的生产菌株，其特征在于：其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，其染色体DNA上一个或多个与L‑苏氨酸合成相关的基因被敲除或弱化，和/或被突变以增强，和/或其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因。

【技术实现步骤摘要】
一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用本申请为申请日为2017年10月13日、申请号为201710953111.8、专利技术名称为“一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于L-高丝氨酸具有L-型-α氨基酸的基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，L-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。目前，国内外生产L-高丝氨酸主要有以下几种方法：(1)化学法；该方法采用相对昂贵的L-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好；(2)化学手性拆分方法；该方法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出L-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大量有机溶剂，对环境有较大污染威胁。(3)生物酶催化法；该方法利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该方法主要问题是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等。(4)微生物发酵法；该方法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，目前的L-高丝氨酸发酵依赖于以质粒为载体的基因过表达体系，其劣势是菌种传代稳定性差。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种稳定的L-高丝氨酸的生产菌株。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种构建L-高丝氨酸生产菌株的基因工程方法。因此，本专利技术提供一种L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于：其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，其染色体DNA上一个或多个与L-苏氨酸合成相关的基因被敲除或弱化，和/或被突变以增强，和/或其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因。优选地，所述被敲除或弱化的基因为thrB和/或thrL；所述被突变以增强的基因为thrA和/或rhtA，所述整合拷贝的基因为thrA*、ppc、pntA、pntB、asd、aspA和aspC中的一个或多个。优选地，所述L-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。本专利技术还提供所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中一步或多步：A、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；B、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因通过点突变过表达或增强功能；C、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因以多拷贝的形式整合到染色体DNA上过表达。优选地，所述步骤A中所述的被敲除或弱化的基因为thrB和/或thrL；所述步骤B中所述的被突变的基因为thrA和/或rhtA；所述步骤B中，thrA和/或rhtA基因分别被突变为thrA*和/或rthA23基因。且所述突变thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性，突变rhtA23具有增加表达量的效果；所述步骤C中所述的通过提高染色体拷贝数来过表达的基因为thrA*、ppc、pntA、pntB、apsA，aspC和asd中的一个或多个。优选地，上述步骤中所述的构建菌株属于大肠杆菌种属。进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。本专利技术还提供所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸中的应用。本专利技术的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：(1)本专利技术通过对L-高丝氨酸代谢途径相关的特定基因的多拷贝整合表达，可实现稳定高产的目的。相对之前报道的通过质粒载体过表达的方式，本专利技术的菌株传代稳定性好，发酵结果稳定，并且产量较之前高。(2)本专利技术所构建的L-高丝氨酸生产菌株在发酵过程中，相对带质粒形式的菌种副产物少，糖酸转化率高。(3)本专利技术的L-高丝氨酸的生产菌株，发酵全程无需使用抗生素，避免了抗生素对环境的污染以及潜在的抗性基因流入环境的可能。具体实施方式实施例中均采用大肠杆菌MG1655构建L-高丝氨酸生产菌株，对所述大肠杆菌基因组中的基因进行敲除和编辑主要是基于Lambda-Red重组、FLP-FRT重组和CRISPR/Cas9技术。可参照文献“LambdaRedRecombinationOne-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.”ProcNatlAcadSciUSA.2000Jun6；97(12):6640-5.和“DevelopmentofafastandeasymethodforEscherichiacoligenomeeditingwithCRISPR/Cas9.”MicrobCellFact.2016Dec1；15(1):205.。实施例中采用的所述温敏质粒具有文献CellFact.2016Dec1；15(1):205.中的温敏质粒所示的DNA序列结构；所述原始菌株大肠杆菌MG1655购买自ATCC；需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本专利技术的目的来说，不同厂家、不同规格的产品并不影响本专利技术的实施。实施例中，所述阿拉伯糖诱导条件具体为：在含20mM阿拉伯糖的LB培养基中，30℃诱导培养。实施例1敲除thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因、突变thrA基因增强菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))的构建。本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为敲除thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因、突变thrA基因的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))的构建，其构建方法可见中国专利申请CN201710106474.8。实施例2在染色体DNA上单拷贝表达thrA*、ppc、aspA、pntA和pntB的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB)的构建。本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为染色体DNA上同时整合表达thrA*、ppc、aspA、pntA和pntB的基因工程菌MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB)，其构建方法可参考文献:MicrobCellFact.2016Dec1；1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于，其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，在其染色体DNA上thrB基因被敲除；thrL基因被敲除；thrA基因被突变为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；以及rhtA、thrA*、ppc、pntAB和aspA基因被过表达或增强，其中所述rhtA的过表达或增强通过rhtA23实现。/n

【技术特征摘要】
1.一种L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于，其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，在其染色体DNA上thrB基因被敲除；thrL基因被敲除；thrA基因被突变为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；以及rhtA、thrA*、ppc、pntAB和aspA基因被过表达或增强，其中所述rhtA的过表达或增强通过rhtA23实现。


2.一种L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于，其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，在其染色体DNA上thrB基因被敲除；thrL基因被敲除；thrA基因被突变为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；以及rhtA、thrA*、ppc、pntAB、aspA、aspC和asd基因被过表达或增强，其中所述rhtA的过表达或增强通过rhtA23实现。


3.如权利要求1或2所述的L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于，所述L-高丝氨酸生产菌株由大肠杆菌种属构建。

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【专利技术属性】
技术研发人员：谢新开，徐伟，
申请(专利权)人：四川利尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51