重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法技术

本发明专利技术公开了一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，该重组大肠杆菌由重组质粒导入宿主大肠杆菌中得到，重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET‑28a(+)连接构建而成，AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。以该重组大肠杆菌为全细胞催化剂，催化底物橙皮素，生物合成香叶木素。该方法绿色高效，反应过程不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，成本低，安全性高，且易于大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法
本专利技术属于生物化工
，涉及一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，具体涉及一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌将橙皮素转化为香叶木素的高效生物合成方法。
技术介绍
香叶木素（Diosmetin）是一种从植物中分离出来的黄酮类化合物，其结构式如下：香叶木素主要存在于柑橘、薄荷等植物中。游离的香叶木素在植物中含量较低，在薄荷中约为0.027%，在柑橘中约为0.016%。香叶木素在植物中主要以芸香糖苷-地奥司明的形式存在，目前香叶木素和地奥司明作为增强静脉张力的血管保护药被大量用于临床治疗，仅地奥司明片这一种药品在国内经由药店零售的部分在2016年销售额就达到了一亿元以上，且以每年10%以上的速度持续增长。香叶木素现阶段的主要获取途径包括：①从植物中直接通过提取分离获得，但由于香叶木素及地奥司明在植物中含量极低，直接提取成本高、难度大，并没有被广泛使用。②现阶段实际生产中，地奥司明和香叶木素使用柑橘果实中含量较高的橙皮苷为原料，以吡啶为溶剂、以碘和溴为催化剂，在高热条件下脱氢获得，但该方法需要使用有毒试剂及大量有机溶剂，既不环保，也不安全。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种重组大肠杆菌，还提供一种绿色高效、可避免使用大量化学试剂、成本低、安全性高、可大规模生产的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案。一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，所述重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET-28a(+)连接构建而成，所述AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，所述AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。上述的重组大肠杆菌，优选的，编码所述AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码所述密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。上述的重组大肠杆菌，优选的，所述宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。所述重组大肠杆菌记为DE3/pAnFNSⅠ。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，所述方法包括先将所述的重组大肠杆菌置于含酵母提取物、蛋白胨和氯化钠的培养基中诱导蛋白表达，所述蛋白胨中含有血红蛋白，然后以橙皮素为催化底物，进行全细胞催化，生物合成香叶木素。上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述全细胞催化时，向催化体系中添加额外的α-酮戊二酸，所述额外的α-酮戊二酸在催化体系中的浓度为20mg/L～100mg/L。上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述全细胞催化时，向催化体系中添加硫酸亚铁，0mg/L＜所述硫酸亚铁在催化体系中的浓度≤200mg/L。上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述含酵母提取物、蛋白栋和氯化钠的培养基为LB培养基或TB培养基。上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述诱导蛋白表达时，诱导培养的温度为10℃～35℃；全细胞催化体系中，所述重组大肠杆菌的浓度为OD600＝0.4～1.2，底物为10mg/L～5000mg/L的橙皮素，催化反应的温度为15℃～35℃。本专利技术中，来源于欧白芷的黄酮合酶1（Flavonesynthase1fromAngelicaarchangelica，AnFNSⅠ）经过密码子优化后，经由pET-28a(+)质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，蛋白诱导表达后，以橙皮素（Hesperetin）作为底物，在重组大肠杆菌菌体内将橙皮素在α-酮戊二酸和亚铁离子的帮助下合成香叶木素（Diosmetin），α-酮戊二酸由重组大肠杆菌本身产生，亚铁离子来源于培养基，也可以额外增加α-酮戊二酸和/或铁源。反应过程如下式（1）所示：式（1）反应中二价铁离子在α-酮戊二酸和分子氧的作用下先生成四价的高活性羰基铁合物，随后铁合物在酶的作用下与底物橙皮素进行反应，经过电子转移-羟化-消去最后得到终产物香叶木素，铁离子则被还原为二价。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术筛选出来源于欧白芷的黄酮合酶1（AnFNSⅠ），经过密码子优化后与表达载体pET-28a(+)连接构建成重组质粒，再导入宿主大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，通过重组大肠杆菌来催化橙皮素合成香叶木素。本专利技术的AnFNSⅠ与现有文献报道可能具有类似催化活性的酶相比具有以下优点：①与不同来源的黄酮合酶1(FNSⅠ)相比，AnFNSⅠ具有更好的催化活性；②与不同类型的黄酮合酶(即FNSⅡ)相比，AnFNSⅠ属于α-酮戊二酸依赖型双加氧酶，可单独发挥作用，便于在工程菌中构建相应的反应体系，而FNSⅡ属于NADPH依赖型P450家族单加氧酶，需要和其他酶(如CPR)或真核生物细胞器协同才能发挥作用；③与同属于α-酮戊二酸依赖型双加氧酶的黄酮醇合酶(FLS)相比，AnFNSⅠ催化橙皮素得到的反应产物主要为香叶木素，而FLS催化橙皮素得到的反应产物主要为未进行分子内消去的4-O-甲基花旗松素；④与未进行密码子优化的野生型AnFNSⅠ相比，本专利技术所给出的优化序列可以显著提高酶在大肠杆菌中的可溶表达。2、本专利技术通过合成生物学途径策略，将香叶木素在植物中的合成途径平移至微生物底盘中，构建具有香叶木素合成能力的工程菌，通过工程菌实现香叶木素的绿色、高效合成有助于解决现阶段香叶木素生产过程中高污染的问题。由于橙皮素在柑橘等植物中含量远高于香叶木素的含量、且橙皮素可以通过含量更高的橙皮苷通过水解获得，因此该方法是一种具有较大潜力的香叶木素生物合成方法，且反应过程不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，易于大规模生产。本专利技术创建的将低值化合物转化为香叶木素的生物合成方法，在较宽的底物浓度范围及反应条件下，均能有效合成香叶木素，与化学合成方法相比，该方法由于不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，在产品安全性及环保方面具有较大优势。3、本专利技术的香叶木素生物合成方法与现有香叶木素的合成方法对比，具有如下表1所示的优势：表1本专利技术的香叶木素生物合成方法与现有香叶木素的合成方法对比表附图说明图1为本专利技术实施例1和实施例2中表达载体pET-28a(+)的结构图。图2为本专利技术实施例1中香叶木素标准品的质谱图。图3为本专利技术实施例1中重组菌种发酵液样品的质谱图。图4为本专利技术实施例1中香叶木素、橙皮素混合标准品的色谱图。图5为本专利技术实施例1中重组菌种发酵液样品的色谱图。图6为本专利技术实施例1中重组菌株转化合成香叶木素的时间曲线图。图7为本专利技术实施例2中重组菌株及对照菌株转化合成香叶木素的时间曲线图。图8为对比例1中密码子优化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，所述重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET-28a(+)连接构建而成，所述AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，所述AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，所述重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET-28a(+)连接构建而成，所述AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，所述AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码所述密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。


4.一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述方法包括先将权利要求1～3中任一项所述的重组大肠杆菌置于含酵母提取物、蛋白胨和氯化钠的培养基中诱导蛋白表达，所述蛋白胨中含有血红蛋白，然后以橙皮素为催化底物，进行全细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：单杨，李高阳，王振，刘娟，操文军，
申请(专利权)人：湖南省农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43