一种用于瘦素免疫调节的口服重组酵母菌株制造技术

本发明专利技术公开了一种用于瘦素免疫调节的口服重组酵母菌株，以酵母菌株作为宿主细胞，宿主细胞中转染有ob基因重组表达载体，通过向哺乳动物肠道DC细胞靶向递送ob基因重组表达载体，在DC细胞中表达出相应的重组瘦素蛋白，重组瘦素蛋白通过DC细胞呈递，使黏膜免疫系统产生瘦素抗体，并通过免疫反应降低血液中的瘦素水平，实现对机体高瘦素导致的瘦素不敏感的肥胖的治疗。胖的治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种用于瘦素免疫调节的口服重组酵母菌株


[0001]本专利技术属于免疫学和蛋白调节
，涉及一种口服重组酵母菌株及其靶向肠道DC递送ob基因DNA的应用。

技术介绍

[0002]肥胖基因又称ob基因，ob基因的表达产物称为瘦素(leptin)，主要由脂肪组织合成和分泌，瘦素(leptin)的主要功能：控制能量代谢、抑制食欲、调节机体的免疫系统、骨的形成、肝脏组织代谢、调节生殖能力。
[0003]最初基于瘦素的肥胖症药物疗法是根据脂平衡观点开发的，即血液中循环瘦素水平的升高促进负能量平衡。最近一系列独立的临床研究结果表明，循环瘦素水平的部分降低(通过外周限制性CB1受体反向激动剂或减肥手术)可能导致体重下降。通过基因突变或药物受体拮抗剂降低或消除瘦素受体活性可导致小鼠严重肥胖。通过瘦素中和抗体减少部分瘦素，可降低SOCS3的表达。此外，PTP1B对瘦素和胰岛素信号通路均有抑制作用，促进肥胖和2型糖尿病的发生。因此，在肥胖的情况下，瘦素作用受损的主要原因可能不是瘦素信号本身的缺陷，而是瘦素信号的结构性激活诱导的有效反馈机制，它也反馈胰岛素信号。部分减少瘦素在ARH中的作用改善了瘦素信号的反馈机制，恢复了瘦素和胰岛素的敏感性。在低瘦素水平动物中，血液中循环瘦素水平降低，会产生体重增加、采食量增加的现象。
[0004]树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是机体内功能最强的抗原呈递细胞(Antigen presenting cells,APC)，能够高效地摄取、加工处理和呈递抗原，处于调控和维持免疫应答的中心环节。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在制药(疫苗)、畜牧(饲料添加剂)以及食品制造中广泛使用，是国际上公认的可以食用的对机体无害的安全菌。和细菌相比，酿酒酵母可以有效的抵抗抗生素作用，同时还可以高效的存活于活体动物的胃肠道环境而不被降解，可用于进行大规模、低成本的口服疫苗生产。
[0005]中国专利201310647359.3公开了“一种口服重组酵母及其介导的靶向肠道DC呈递shRNA的应用”，其通过基因工程酵母向活体动物肠道树突状细胞靶向递送shRNA干扰载体，利用干扰RNA调节树突状细胞中目的基因的表达，通过降低树突状细胞CD40蛋白表达，可用于治疗自身免疫病等疾病。但目前，尚未见到通过口服重组酵母，实现肠道DC呈递瘦素相关抗原，并通过体液免疫调节瘦素蛋白水平的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于瘦素免疫调节的口服重组酵母菌株，实现对机体高瘦素导致的瘦素不敏感的肥胖的治疗。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0008]一种口服重组酵母菌株，以酵母菌株作为宿主细胞，宿主细胞中转染有ob基因重组表达载体。
[0009]优选的，所述重组表达载体选自JMB84-CMV-ob载体或JMB84-CMV-OVA-ob载体，
JMB84-CMV-ob载体包括ob基因表达盒(具有CMV启动子-ob基因序列-polyA的元件排列)；JMB84-CMV-OVA-ob载体包括OVA基因与ob基因的串联表达盒(具有CMV启动子-OVA基因序列-ob基因序列-polyA的元件排列)，CMV启动子使重组表达载体能够在哺乳动物细胞中表达出相应的蛋白，但在酵母菌中不表达，鸡卵清白蛋白(OVA)用于增强重组表达载体在哺乳动物细胞中表达蛋白的免疫原性。
[0010]优选的，所述重组表达载体是通过酶切连接将ob基因序列克隆到载体JMB84-CMV-OMPG(参见SEQ.ID.NO.3)或JMB84-CMV-OVA-OMPG(参见SEQ.ID.NO.4)上，并替换OMPG(细菌外膜蛋白G)基因序列而得到的。
[0011]优选的，所述ob基因序列选自序列ob-1或序列ob-2，ob-1、ob-2是采用不同引物扩增的含有ob基因CDS的DNA片段，ob-1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，ob-2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
[0012]优选的，所述宿主细胞为酿酒酵母。
[0013]优选的，所述重组表达载体通过LiAc的方法转染到宿主细胞中。
[0014]上述口服重组酵母菌株在制备靶向肠道树突状细胞递送ob基因DNA的免疫制剂中的应用或者在制备用于治疗肥胖症(高脂血症状态)的药物中的应用。
[0015]优选，所述免疫制剂选自DNA疫苗、用于增强体液免疫的佐剂或用于促进树突状细胞成熟的佐剂。
[0016]优选的，所述口服重组酵母菌株通过向哺乳动物肠道树突状细胞靶向递送ob基因重组表达载体，在树突状细胞中表达出相应的重组瘦素蛋白，重组瘦素蛋白通过树突状细胞呈递，使黏膜免疫系统产生瘦素抗体，并通过免疫反应降低血液中的瘦素(循环瘦素)水平，从而调节哺乳动物的食量及体重，及调节肝脏中脂滴的沉积。
[0017]本专利技术的有益效果体现在：
[0018]本专利技术提供的口服重组酵母能够穿过活体生物的胃肠道环境，靶向肠道DC细胞递送ob基因DNA(具体通过JMB84-CMV-ob、JMB84-CMV-OVA-ob这两个载体递送)，从而通过黏膜免疫系统产生瘦素抗体，降低血液中的瘦素水平，对于高瘦素情况的肥胖，可以有效的恢复机体瘦素敏感性及瘦素的正常功能，降低总胆固醇和甘油三酯，以及减少体重的增加，抑制食欲、降低食量，降低肝脏中脂滴的沉积。
[0019]本专利技术提供的口服重组酵母可以应用在缓解和治疗肥胖症的高脂血症状态(通过降低瘦素水平，提高瘦素敏感性，消除瘦素抵抗)，在应用中无需体外生产中性瘦素抗体(中性瘦素抗体制备、纯化方法复杂，通过注射治疗肥胖)，通过口服饲喂就能到达到明确的治疗效果，为肥胖症的高脂血症状态治疗提供新的途径。
[0020]进一步的，酿酒酵母作为一种常用的安全模式生物，对生物体没有副作用，因此作为药物传递载体是可行的。
附图说明
[0021]图1为ob基因PCR扩增产物的电泳图；其中，(a)ob-1扩增产物，(b)ob-2扩增产物(泳道1～8分别为扩增结果的八个重复)，M表示Marker。
[0022]图2为BamHI/XhoI酶切鉴定JMB84-CMV-ob载体的电泳图；其中，M表示Marker。
[0023]图3为JMB84-CMV-ob载体图谱；其中，leptin-F1和leptin-R1指的是ob基因CDS(ob
基因表达出的相应蛋白叫瘦素，即leptin)的上游引物ob-F1和下游引物ob-R1。
[0024]图4为NheI/XhoI酶切鉴定JMB84-CMV-OVA-ob载体的电泳图；其中，M表示Marker，泳道1、2分别为酶切鉴定JMB84-CMV-OVA-ob载体的两个重复。
[0025]图5为JMB84-CMV-OVA-ob载体图谱；其中，leptin-F1和leptin-R1指的是ob基因CDS(ob基因表达出的相应蛋白叫瘦素，即leptin)的上游引物o本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种口服重组酵母菌株，其特征在于：以酵母菌株作为宿主细胞，宿主细胞中转染有ob基因重组表达载体。2.根据权利要求1所述一种口服重组酵母菌株，其特征在于：所述重组表达载体选自JMB84-CMV-ob载体或JMB84-CMV-OVA-ob载体，JMB84-CMV-ob载体包括ob基因表达盒；JMB84-CMV-OVA-ob载体包括OVA基因与ob基因的串联表达盒。3.根据权利要求1所述一种口服重组酵母菌株，其特征在于：所述重组表达载体是将ob基因序列克隆到载体JMB84-CMV-OMPG或JMB84-CMV-OVA-OMPG，并替换对应载体上的OMPG基因序列而得到的。4.根据权利要求3所述一种口服重组酵母菌株，其特征在于：所述ob基因序列包括ob基因CDS。5.根据权利要求1所述一种口服重组酵母菌株，其特征在于：所述宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智英，岳峰，徐坤，韩宝泉，王如玉，张潇筠，李晓玉，姚长长，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：