一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒。靶标基因组合包括B646L、B962L、C717R、D1133L和G1340L基因，所述分别靶向前述基因的引物组由SEQ ID No.1～30所示的核苷酸序列组成。用其制得的非洲猪瘟多重核酸检测试剂盒，利用蜂巢芯片和LAMP直扩法建立了整个检测流程。与现有技术相比，本发明专利技术针对ASFV的多个基因设计引物，结合芯片实现一次反应同时检测多个基因，能有效避免因单个基因突变而造成的假阴性结果，且无需核酸提取步骤，既能实现多重可视化检测，又不依赖精密仪器和专业操作，具有准确、快速、简便等优点，适合口岸检验检疫和现场即时检测，具有良好应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒
本专利技术涉及检验检疫
，具体涉及一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒(ASFV)检测中的应用及试剂盒，尤其涉及一种基于蜂巢芯片的非洲猪瘟病毒多重核酸检测试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起猪的一种急性、高度传染性和致死性的疾病，其特征是发病时间短，死亡率高达100％，临床表现为高热、腹泻、皮肤和内脏广泛性出血等(Normile,D.,2018,Science,361,741；Ma,J.,etal.,2020,PreventiveVeterinaryMedicine,175,104861；Galindo,I.,&Alonso,C,2017,Viruses,9(5),103)。ASF最早于1921年报道于非洲的肯尼亚地区，之后迅速扩散到欧洲、拉美和亚洲等60多个国家，给世界造成了巨大的经济损失(Montgomery,R.E.,1921,Journalofcomparativepathologyandtherapeutics,34,159-191；Costard,S.,etal.,2013,Virusresearch,173(1),191-197；DeiGiudici,S.,2019,Archivesofvirology,164(3),739-745)。2018年8月，ASF首次在中国辽宁沈阳爆发，随后迅速波及其他多个省份。截止2020年3月5日，中国已有32个省份共爆发了165起非洲猪瘟疫情，累计扑杀生猪1,193,000头，给中国乃至全世界的养猪业带来了巨大的威胁(http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/ASF/situation_update.html)。根据世界动物卫生组织(OIE)发布的2019版动物疫病通报名录，ASF被列为必需通报的动物疫病。ASFV是一种呈二十面体对称的dsDNA病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一已知的虫媒病毒。ASFV的基因组巨大，长度约170～190kb，共编码150～200种蛋白质(Alonso,C.,etal.,2018,JournalofGeneralVirology,99(5),613-614；Wang,N.,etal.,2019,Science,366(6465),640-644)。由于ASFV复杂的基因组成和高度变异性，已根据同源性较高的编码衣壳蛋白Vp72的基因B646L被划分为24个基因型，也有结合其他基因如B602L被划分为更多亚型(QuemboCJ.,etal.,2018,TransboundEmergDis,65(2):420–431)。目前，ASF尚无有效的治疗方式和疫苗，扑杀和焚烧是防止疫情蔓延最有效的手段，因此快速、准确地检测ASFV至关重要。现有的ASFV检测方法可以分为两类：(1)免疫学检测方法，包括病毒分离法(Rowlands,R.J.,etal.,2008,Emerginginfectiousdiseases,14(12),1870)、红细胞吸附试验(Rodríguez,J.M.,etal.,1993,Journalofvirology,67(9),5312-5320)、酶联免疫吸附测定(Cubillos,C.,etal.,2013,Virusresearch,173(1),159-167)、荧光抗体检测(Gallardo,C.,etal.,2015,Journalofclinicalmicrobiology,53(8),2555-2565)等。虽然病毒分离法(VI)和红细胞吸附试验(HAD)非常可靠和有效，但耗时较长，操作繁琐，需要高质量的组织来培养细胞，不适合快速检测。酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光抗体检测(FAT)操作简便，可以准确识别ASFV的抗体，但它们受限于检测灵敏度，在感染初期无法准确检测，猪在抗体阳性之前就可能因病毒感染而亡。因此，分子生物学检测因其操作简便快速、高灵敏度和高特异性而成为主流检测方法。(2)分子生物学检测方法，包括荧光定量PCR(M.,etal.,2003,Journalofclinicalmicrobiology,41(9),4431-4434)、LAMP(James,H.E.,etal.,2010,Journalofvirologicalmethods,164(1-2),68-74)、RPA(Wang,J.,etal.,2017,CanadianJournalofVeterinaryResearch,81(4),308-312)等。荧光定量PCR是被世界动物卫生组织(OIE)认定的实验室检测ASFV的金标准，但依赖于精密的热循环仪器和专业操作人员，不适用于资源有限地区的现场检测。等温扩增由于其操作简便、无需精密仪器、耗时短等优点，在分子检测领域发挥越来越重要的作用。近年来，许多研究人员将LAMP或RPA与CRISPR系统和试纸条结合用于ASFV的检测，既能提高灵敏度，又能实现现场快速检测(WangX.,etal.,2020,ACSNano,14(2):2497–2508；Yuan,C.Q.,ETAL.,2019,AnalChem,92(5):4029–4037；Wang,X.,etal.,2020,CommunicationsBiology,3(1):62；Bai,J.,etal.,2019,FrontiersinMicrobiology,10:2830)，但它们需要先通过等温扩增富集产物，再转移到检测体系中，扩增和检测相分离，开盖容易造成气溶胶污染，引起假阳性结果，并且增加了操作步骤。此外，以上提及的所有方法都只靶向ASFV的单个基因，例如编码病毒衣壳蛋白VP72的基因B646L(Wang,J.,etal.,2017,CanadianJournalofVeterinaryResearch,81(4),308-312)，编码拓扑异构酶II的基因P1192R(James,H.E.,etal.,2010,Journalofvirologicalmethods,164(1-2),68-74)，编码DNA结合蛋白Vp10的基因K78R(Wang,D.,etal.,2020,Journalofvirologicalmethods,276:113775)，很容易因为ASFV庞大、复杂而多变的基因组特点，引起由单个基因突变带来的假阴性结果。现有专利文献CN110373500A公开了一种双重荧光PCR检测试剂盒，选用了针对非洲猪瘟病毒的两个基因(B646L和B438L)的保守片段的引物和探针。另专利文献CN111020062A公开了一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量PCR试剂盒，针对非洲猪瘟病毒CD2V、VP72、MGF-36014L三个基因。但它们的不足之处在于PCR是变温反应，需要依赖精密的多通道荧光PCR仪，价格昂贵，体积庞大，不适合猪场的现场即时检测。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶标基因组合在非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用，其特征在于，所述靶标基因组合包括B646L、B962L、C717R、D1133L和G1340L基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶标基因组合在非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用，其特征在于，所述靶标基因组合包括B646L、B962L、C717R、D1133L和G1340L基因。


2.一种非洲猪瘟病毒多基因检测的LAMP引物组，其特征在于，所述的引物组包含5套LAMP引物，分别靶向非洲猪瘟病毒的5个基因：B646L、B962L、C717R、D1133L、G1340L，由SEQIDNo.1～No.30所示的核苷酸序列组成。


3.一种非洲猪瘟病毒多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的LAMP引物组。


4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含蜂巢芯片、加样接头、样本裂解液、LAMP反应液、阳性和阴性对照、封口膜、反应管。


5.根据权利要求3或4所述的非洲猪瘟病毒多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的LAMP引物组是经过PCR管内和芯片上的LAMP反应层层筛选获得，分别被预固定在蜂巢芯片的相应位置上。


6.根据权利要求4所述的非洲猪瘟病毒多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的蜂巢芯片经过疏水修饰和引物预固定后被固定于反应管中；
所述的加样接头可以与蜂巢芯片和反应管紧密结合；
所述的样本裂解液的主要成分是NaOH；
所述的LAMP反应液含有1×...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱元首，李阳，陶生策，
申请(专利权)人：上海真测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31