一种检测果蔬中诺如病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测果蔬中诺如病毒的方法，包括如下步骤：步骤1、将果蔬样品与洗脱缓冲液混合，收集上清液；步骤2、在所述上清液中加入磁性探针，捕获所述上清液中的诺如病毒；步骤3、将结合诺如病毒的磁性探针加入到溶液中，加热离心后取上清得到含有诺如病毒RNA的溶液，并进行RT‑(q)PCR检测。本发明专利技术提供的磁性探针可有效分离、富集果蔬中的微量诺如病毒，进而提高了诺如病毒的检测灵敏度，相比于传统的基于PEG(聚乙二醇)沉淀的检测方法灵敏度提高3个数量级。

【技术实现步骤摘要】
一种检测果蔬中诺如病毒的方法
本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种检测果蔬中诺如病毒的方法。
技术介绍
诺如病毒是引起人急性非细菌肠胃炎的主要病原体之一。近几年来不论国内还是国外都经常爆发由诺如病毒引起的病例，尤其是在人员密集的学校、医院、游轮等。根据美国CDC网站最新数据显示(2020)，在世界范围内，每5例急性肠胃炎病中就有1例是因为诺如病毒引起的，每年由诺如病毒感染造成的急性肠胃炎病例约6.85亿例，其中，5岁以下的儿童感染病例大约为2亿例，其中约5万儿童病例丧生，尤其是在发展中国家更是深受其害。虽然目前的RT-(q)PCR是检测诺如病毒的“金标准”，但是面对多种多样的果蔬样品，当直接使用RT-(q)PCR检测方法检测果蔬中的诺如病毒时，由于果蔬样品中的诺如病毒含量过低，即使RT-(q)PCR有强大的扩增能力，也依然会导致RT-(q)PCR检测方法无法精确的检测诺如病毒。基于诺如病毒的低剂量致病性，如何对果蔬中的诺如病毒进行高效的分离和富集，提高诺如病毒检测方法的灵敏度，受到了越来越多的关注。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是目前诺如病毒检测方法灵敏度低的问题。为实现上述目的，本专利技术提供了一种检测果蔬中诺如病毒的方法，包括如下步骤：步骤1、将果蔬样品与洗脱缓冲液混合，收集上清液；步骤2、在所述上清液中加入磁性探针，捕获所述上清液中的诺如病毒；步骤3、将结合诺如病毒的磁性探针加入到溶液中，加热离心后取上清得到含有诺如病毒RNA的溶液，并进行RT-(q)PCR检测；其中，所述磁性探针包括羧基化硅包Fe3O4磁性粒子和猪胃粘膜蛋白，所述羧基化硅包Fe3O4磁性粒子和所述猪胃粘膜蛋白通过偶联剂共价结合。进一步地，步骤1中，所述洗脱缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，包括0.01-1％曲拉通、10-50U果胶酶、0.01-0.1mol/L甘氨酸，pH为8-11。进一步地，步骤1中，将所述果蔬样品和所述洗脱缓冲液混合20-60min。进一步地，步骤2中，所述磁性探针通过包括如下步骤制备得到：步骤2.1、将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O溶解于去离子水中，在氮气保护下加入氨水，制备得到Fe3O4磁性纳米粒子；步骤2.2、将环己烷、正己醇、曲拉通与水混合得到反相微乳液，并加入所述Fe3O4磁性纳米粒子，随后将氨水、TEOS依次加入到所述反相微乳液中，反应得到硅包Fe3O4磁性纳米粒子；步骤2.3、将所述硅包Fe3O4磁性纳米粒子分散于甲苯中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气保护下反应得到氨基化硅包Fe3O4磁性纳米粒子；步骤2.4、将所述氨基化硅包Fe3O4磁性纳米粒子分散于二甲基甲酰胺中，加入丁二酸酐，反应得到羧基化硅包Fe3O4磁性粒子；步骤2.5、将所述羧基化硅包Fe3O4磁性粒子加入到2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，加入EDC反应30min后收集沉淀，将沉淀复溶于所述2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，加入猪胃粘膜蛋白、甘氨酸后得到所述磁性探针。进一步地，步骤2中，调节所述上清液的pH为9.5。进一步地，步骤2中，磁性探针的添加量为20-150μg。进一步地，步骤2中，所述磁性探针与所述上清液的混合时间为10-50min。进一步地，步骤3中，所述加热温度为80-100℃，加热时间为5-20min，进一步地，步骤3中，所述离心的转速为10000rpm-20000rpm，离心时间为5-30min。进一步地，步骤3中，所述溶液为无RNA酶的水。本专利技术的实施具有以下有益效果：1、本专利技术提供的磁性探针可有效分离、富集果蔬中的微量诺如病毒，进而提高了诺如病毒的检测灵敏度，相比于传统的基于PEG沉淀的检测方法灵敏度提高3个数量级；2、本专利技术可适用于草莓、蓝莓、番茄、葡萄、生菜、香菜、洋葱、罗勒、葱等果蔬样品中的诺如病毒检测；3、本专利技术的磁性捕获探针与诺如病毒的最佳结合pH为9.5，此pH也是诺如病毒洗脱的最佳pH值，确保诺如病毒分离与富集效率更高；4、本专利技术提供的洗脱缓冲液中加入了果胶酶以及甘氨酸，提高了果蔬样品中诺如病毒的洗脱效率；此外，洗脱缓冲液中的表面活性剂也进一步提高了果蔬样品中诺如病毒的洗脱效率，而且也会减少磁性探针与管壁等非特异性吸附，提高磁性探针的回收效率。以下将结合具体实施例对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1A为实施例3提供的检测方法的检测结果示意图；图1B为对比例1提供的检测方法的检测结果示意图。具体实施方式以下参考说明书附图介绍本专利技术的多个优选实施例，使其
技术实现思路
更加清楚和便于理解。本专利技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本专利技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。以下实施例中所使用到的试剂可购自Sigma-Aldrich公司、上海国药集团、上海精纯试剂有限公司、上海索莱宝生物科技有限公司，所用试剂如无特别说明均为分析纯。本专利技术提供了一种诺如病毒的检测方法，包括如下步骤：步骤1、将果蔬样品与洗脱缓冲液混合，收集上清液；本步骤主要使用洗脱缓冲液清洗果蔬样品，使果蔬样品中的诺如病毒分散在洗脱缓冲液中；所述洗脱缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris·HCl)缓冲溶液，包括0.01-1％曲拉通(TritonX100)、10-50U果胶酶、0.01-0.1mol/L甘氨酸，pH为8-11。将样品和洗脱缓冲液在离心管或均质袋中摇晃20-60min，收集上清液。步骤2、在所述上清液中加入磁性探针；本步骤主要使用磁性探针捕获洗脱液中的诺如病毒；其中，所述磁性探针的制备方法为：步骤2.1、制备Fe3O4磁性纳米粒子：将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O按照摩尔比2:1溶解于150mL去离子水中，在氮气保护下加热到85℃，并快速加入7.5mL氨水，持续加热25min，然后冷却至室温，收集得到的黑色沉淀物，随后用乙醇和去离子水反复清洗，真空干燥得到Fe3O4磁性纳米粒子；步骤2.2、制备硅包Fe3O4磁性纳米粒子：将环己烷、正己醇、曲拉通(TritonX100)按照体积比4:1:1混合，与2.5mL水组成反相微乳液体系，将Fe3O4磁性纳米粒子分散在反相微乳液体系中，依次加入0.9mL氨水和1.5mLTEOS，反应24h，使得TEOS发生水解包裹在Fe3O4磁性纳米粒子周围，收集得到的沉淀物，用乙醇和水进行反复洗涤，真空干燥得到硅包Fe3O4磁性纳米粒子；步骤2.3、制备氨基化硅包Fe3O4磁性纳米粒子：将步骤2.2制备得到的硅包Fe3O4磁性纳米粒子分散于甲苯中，加入3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在氮气保护下80℃下回流12h，收集沉淀物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测果蔬中诺如病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1、将果蔬样品与洗脱缓冲液混合，收集上清液；/n步骤2、在所述上清液中加入磁性探针，捕获所述上清液中的诺如病毒；/n步骤3、将结合诺如病毒的磁性探针加入到溶液中，加热离心后取上清得到含有诺如病毒RNA的溶液，并进行RT-(q)PCR检测；/n其中，所述磁性探针包括羧基化硅包Fe

【技术特征摘要】
1.一种检测果蔬中诺如病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将果蔬样品与洗脱缓冲液混合，收集上清液；
步骤2、在所述上清液中加入磁性探针，捕获所述上清液中的诺如病毒；
步骤3、将结合诺如病毒的磁性探针加入到溶液中，加热离心后取上清得到含有诺如病毒RNA的溶液，并进行RT-(q)PCR检测；
其中，所述磁性探针包括羧基化硅包Fe3O4磁性粒子和猪胃粘膜蛋白，所述羧基化硅包Fe3O4磁性粒子和所述猪胃粘膜蛋白通过偶联剂共价结合。


2.如权利要求1所述的检测果蔬中诺如病毒的方法，其特征在于，步骤1中，所述洗脱缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，包括0.01-1％曲拉通、10-50U果胶酶、0.01-0.1mol/L甘氨酸，pH为8-11。


3.如权利要求1或2所述的检测果蔬中诺如病毒的方法，其特征在于，步骤1中，将所述果蔬样品和所述洗脱缓冲液混合20-60min。


4.如权利要求1所述的检测果蔬中诺如病毒的方法，其特征在于，步骤2中，所述磁性探针通过包括如下步骤制备得到：
步骤2.1、将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O溶解于去离子水中，在氮气保护下加入氨水，制备得到Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤2.2、将环己烷、正己醇、曲拉通与水混合得到反相微乳液，并加入所述Fe3O4磁性纳米粒子，随后将氨水、TEOS依次加入到所述反相微乳液中，反应得到硅包Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤2.3、将所...

【专利技术属性】
技术研发人员：白亚龙，周昌艳，张绪富，索玉娟，戴迎春，瞿洋，邵毅，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，南方医科大学，
类型：发明
国别省市：上海;31