一种用于新型冠状病毒核酸检测的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于新型冠状病毒核酸检测的多重实时荧光RT‑PCR引物探针组合物及试剂盒。该试剂盒包含检测SARS‑CoV‑2的ORF1ab基因和N基因的多重实时荧光RT‑PCR引物和探针；其中用于扩增ORF1ab基因的上游引物如SEQ ID NO：1所示、下游引物如SEQ ID NO：2所示，用于检测ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID NO：3所示；用于扩增N基因的上游引物如SEQ ID NO：4所示、下游引物如SEQ ID NO：5所示，用于检测N基因的探针序列如SEQ ID NO：6所示。经过中美两国临床验证，可满足国内外临床样本的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于新型冠状病毒核酸检测的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物及试剂盒
本专利属于医疗体外诊断领域，涉及一种用于新型冠状病毒核酸检测的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物及试剂盒。
技术介绍
国家卫健委发布的各版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(现更新至试行第八版)，均明确将实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸阳性列为确诊标准之一，及时准确地鉴定出SARS-CoV-2，是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)得以合理临床治疗和疫情科学防控的前提基础。然而，疫情暴发之初，国家药品监督管理局启动《医疗器械应急审批程序》以满足大量检测需要，所致试剂厂商在最短时间内完成了核酸检测试剂盒的研发和审批，对试剂盒检测原理和性能参数设置上难免存有瑕疵。具有临床表现而核酸检测连续多次阴性，以及临床症状减轻却核酸检测“复阳”病例的接续报道，反映出核酸检测试剂盒所存在的一定问题。其中，用于病毒核酸检测的PCR引物及探针的设计，以及多靶标同步扩增的体系参数设置，是影响检测方法特异度和灵敏度的关键因素。当前，已投入临床使用的商品化试剂盒，在其PCR引物及探针设计时，大多仅以我国最初报道的Wuhan-Hu-1病毒株(NC_045512)作为设计模板，而SARS-CoV-2作为RNA病毒易发生变异，从而造成一定程度的漏检。目前，我国境内疫情基本得到控制，但全球疫情仍在蔓延，抗疫重点转向防控境外输入，在这一新形势下，试剂盒能否满足境外病毒流行株的检出显得尤为重要。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于SARS-CoV-2核酸检测的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物及试剂盒，以实现对国内外已报道SARS-CoV-2的检出，解决现有试剂盒存在的漏检问题。本专利技术的技术方案如下：一种用于新型冠状病毒检测的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物，包含检测SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因的多重实时荧光RT-PCR引物和探针；其中用于扩增ORF1ab基因的上游引物如SEQIDNO：1所示、下游引物如SEQIDNO：2所示，用于检测ORF1ab基因的探针序列如SEQIDNO：3所示；用于扩增N基因的上游引物如SEQIDNO：4所示、下游引物如SEQIDNO：5所示，用于检测N基因的探针序列如SEQIDNO：6所示。作为本专利技术的一种优选，所述的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物，还包含检测人β-Actin基因的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物。作为本专利技术的进一步优选，用于扩增人β-Actin基因的上游引物如SEQIDNO：7所示，下游引物如SEQIDNO：8所示，用于检测人β-Actin基因的探针序列如SEQIDNO：9所示。本专利技术探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。本专利技术探针的5’修饰物选自本领域常用的报告荧光基团，如FAM、TexasRed、JOE；本专利技术探针的3’修饰物选自本领域常用的淬灭荧光基团，如BHQ1、BHQ2、ECLIPSE。且每个基因的报告荧光基团和淬灭荧光基团不相同。作为本专利技术的一种优选，用于检测ORF1ab基因的探针5’修饰FAM，3’修饰BHQ1；用于检测N基因的探针5’修饰TexasRed，3’修饰BHQ2；用于检测人β-Actin基因的探针5’修饰JOE，3’修饰ECLIPSE。本专利技术所述的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物在制备新型冠状病毒检测试剂中的应用。一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包含所述的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物。所述的针对ORF1ab和N基因的PCR引物对与探针，其设计模板序列并非Wuhan-Hu-1病毒株(NC_045512)一条，而是综合参考了2020年6月25日前公开报道的全部病毒株序列。具体地讲，下载“国家生物信息中心-2019新型冠状病毒信息库”(https://bigd.big.ac.cn/ncov/release_genome)中所有序列完整度为Complete且质量评估为High的序列，保存为本地文件，去除ORF1ab与N基因之外的序列后，提交“欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所”(EMBL-EBI)，使用ClustalOmega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)多重序列比对工具得到一致性序列及序列中各碱基的一致率，以此一致性序列作为引物与探针的设计模板。如此实现对数据库中全部病毒株的检测，最大程度避免因病毒核酸变异所致的漏检。所述的ORF1ab和N基因的引物和探针有多条设计结果，按照PCR引物设计通用原则为每对引物和每条探针优选3个设计结果，将ORF1ab基因的一对引物和一条探针、N基因的一对引物和一条探针以及人β-Actin基因的引物对与探针组合成多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物，共形成9套引物探针组合物(组合示例见表1)。对每套组合物中共9条引物探针间二聚体形成情况进行分析，选择最优的2套组合物进行实验性能比较。表1PCR引物探针组合示例作为本专利技术的进一步优选，所述针对ORF1ab和N基因的引物及探针组合物其序列见表2，该组合对SARS-CoV-2检测高度特异。表2SARS-CoV-2ORF1ab与N基因的PCR引物和探针序列作为本专利技术的优选，每条引物与探针参与反应的终浓度比为2:1。作为本专利技术的优选，所述的试剂盒还包含RT-PCR反应液、阳性质控品与阴性质控品。作为本专利技术的进一步优选，所述的RT-PCR反应液包含RT-PCR缓冲液、逆转录酶及热启动Taq酶。作为本专利技术的进一步优选，所述的阳性质控品为包含PCR扩增靶序列的体外转录RNA片段(序列见表3)。由此保证了质控品与样本被测物化学属性一致，最大程度模拟临床样本以监控RT-PCR全程反应的同时，避免了使用灭活病毒或假病毒所带来的感染风险。表3阳性质控品中体外转录RNA序列作为本专利技术的进一步优选，所述的阴性质控品为阳性质控品的溶剂基质，不含PCR可扩增靶物质。所述试剂盒包含A组分与B组分，A组分为上述引物探针组合物，B组分包含浓缩的RT-PCR缓冲液、逆转录酶及热启动Taq酶，在临床应用时仅需将A、B两组分混合即完成反应液的配置，加入RNA样本后进行一步法多重荧光RT-PCR，就可同时对SARS-CoV-2病毒的ORF1ab和N基因以及人源采样质控基因β-Actin进行检测，使得操作简便快捷。本专利技术适用仪器为实时荧光定量PCR仪，如ABI7500系列、Roche480系列、Bio-RadCFX96、宏石SLAN系列等。由于以上技术方案的实施，本专利技术的有益效果是：本专利技术公开了一种用于新型冠状病毒核酸检测的多重实时荧光RT-PCR引物探针组合物及试剂盒，该试剂盒中引物探针的设计基于病毒信息库，最大程度避免因病毒核酸变异所致的漏检；优选引物探针组合物的试剂盒对S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于新型冠状病毒检测的多重实时荧光PCR引物探针组合物，其特征在于包含检测SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因的多重实时荧光PCR引物和探针；其中用于扩增ORF1ab基因的上游引物如SEQ ID NO：1所示、下游引物如SEQ ID NO：2所示，用于检测ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID NO：3所示；用于扩增N基因的上游引物如SEQ ID NO：4所示、下游引物如SEQ ID NO：5所示，用于检测N基因的探针序列如SEQ ID NO：6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒检测的多重实时荧光PCR引物探针组合物，其特征在于包含检测SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因的多重实时荧光PCR引物和探针；其中用于扩增ORF1ab基因的上游引物如SEQIDNO：1所示、下游引物如SEQIDNO：2所示，用于检测ORF1ab基因的探针序列如SEQIDNO：3所示；用于扩增N基因的上游引物如SEQIDNO：4所示、下游引物如SEQIDNO：5所示，用于检测N基因的探针序列如SEQIDNO：6所示。


2.一种用于新型冠状病毒检测的多重实时荧光PCR引物探针组合物，其特征在于还包含人β-Actin基因的多重实时荧光PCR引物探针组合物。


3.根据权利要求2所述的多重实时荧光PCR引物探针组合物，其特征在于用于扩增人β-Actin基因的上游引物如SEQIDNO：7所示，下游引物如SEQIDNO：8所示，用于检测人β-Actin基因的探针序列如SEQIDNO：9所示。


4.权利要求1-3中任一项所述的多重实时荧光PCR引物探针组合物在制备新型冠状病...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘世扬，顾春荣，穆原，徐建，谢梦晓，陶剑峰，潘玥，
申请(专利权)人：江苏科德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32