一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其检测方法技术

本申请属于试剂盒领域，具体为一种基于LFD‑RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物、探针、阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、测流层析检测试剂、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。本发明专利技术的RMA结合侧流层析技术检测新型冠状病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的新型冠状病毒的快速筛查检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其检测方法
本申请属于试剂盒领域，具体为一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其的检测方法。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎，是指由于新型冠状病毒感染所导致的肺炎。新型冠状病毒是一种RNA病毒，这种病毒传染性极强，人群普遍易感，且潜伏期比较长。为了阻止新型冠状病毒传播范围的不断扩大，使新冠肺炎疫情得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。目前对新型冠状病毒核酸检测的方法主要为实时荧光定量PCR法，但是常规的PCR检测需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作过程、较长的检出时间以及专业的技术人员进行操作。重组酶介导扩增技术(RMA)是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。与PCR相比，RMA具有反应温度恒定、操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA技术可以与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合进行扩增产物的检测。在RMA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被核酸外切酶III识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RMA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。本专利技术采用LFD-RMA技术建立快速检测新型冠状病毒的方法，为新冠病毒的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其的检测方法，本申请是通过下述方案实现的：一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，上游引物序列ORF1ab-F为：5’-TACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCAC-3’；下游引物序列ORF1ab-R为：5’-[Biotin]AATTTCAGCAGGACAACGCCGACAAGTTCCGAGG-3’；探针序列ORF1ab-P为：5’-[FAM]CATTGCTAACTAAGGGCACACTAGAACCAGAAT[dSpacer]ATTTCAATTCAGTGT[C3-spacer]-3’。优选的，所述试剂盒还包括：阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、侧流层析检测试纸条、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。优选的，所述阳性标准品为新型冠状病毒的ORF1ab基因片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒；所述阴性标准品为无菌双蒸水。优选的，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。优选的，所述试剂盒的RMA扩增反应试剂的配比如下：试剂终浓度Tris50mM醋酸镁100mM聚环氧乙烷10％(w/v)海藻糖2mM甘露醇2.5mMATP10mMdNTPs2mM肌酸激酶1000ng/mL磷酸肌酸25mM引物10μM探针10μM大肠杆菌RecA蛋白100ng/μLUvsY蛋白40ng/μL单链结合蛋白GP32800ng/μLBst聚合酶60ng/μL核酸外切酶III80ng/μL各试剂的终浓度如表。一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒的检测方法，步骤如下：(1)提取待检测样本的总RNA，通过反转录获得cDNA；(2)将反转录得到的cDNA中加入扩增反应试剂，置于恒温水浴锅中进行RMA反应，反应条件为：38℃水浴5min后，混匀，再38℃水浴15min；(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有新型冠状病毒核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有新型冠状病毒核酸。优选的，待测样本选自咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物的至少一种。有益效果：与普通PCR方法相比，本申请仅需要恒温水浴锅在37-42℃即可完成反应，对仪器设备要求低，无需热循环仪器，操作更加简单；其次，本申请检测速度快，反应时间在30min之内即可完成；第三，可实现检测结果的可视化。因此，本专利技术的RMA结合侧流层析技术检测新型冠状病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的新型冠状病毒的快速筛查检测。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1：RMA反应温度的筛选结果图；图2：RMA反应时间的筛选结果图；图3：新型冠状病毒RMA-侧流层析试纸条检测方法的灵敏性试验；图4：新型冠状病毒RMA-侧流层析试纸条检测方法的特异性试验。具体实施方式为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。实施例1一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，针对新型冠状病毒特异性基因ORF1ab设计RMA引物与探针，如下：上游引物序列ORF1ab-F为：5’-TACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCAC-3’；下游引物序列ORF1ab-R为：5’-[Biotin]AATTTCAGCAGGACAACGCCGACAAGTTCCGAGG-3’；探针序列ORF1ab-P为：5’-[FAM]CATTGCTAACTAAGGGCACACTAGAACCAGAAT[dSpacer]ATTTCAATTCAGTGT[C3-spacer]-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，/n上游引物序列ORF1ab-F为：/n5’-TACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCAC-3’；/n下游引物序列ORF1ab-R为：/n5’-[Biotin]AATTTCAGCAGGACAACGCCGACAAGTTCCGAGG-3’；/n探针序列ORF1ab-P为：/n5’-[FAM]CATTGCTAACTAAGGGCACACTAGAACCAGAAT[dSpacer]ATTTCAATTCAGTGT[C3-spacer]-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，
上游引物序列ORF1ab-F为：
5’-TACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCAC-3’；
下游引物序列ORF1ab-R为：
5’-[Biotin]AATTTCAGCAGGACAACGCCGACAAGTTCCGAGG-3’；
探针序列ORF1ab-P为：
5’-[FAM]CATTGCTAACTAAGGGCACACTAGAACCAGAAT[dSpacer]ATTTCAATTCAGTGT[C3-spacer]-3’。


2.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、侧流层析检测试纸条、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。


3.如权利要求2所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为新型冠状病毒的ORF1ab基因片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒；所述阴性标准品为无菌双蒸水。


4.如权利要求3所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。


5.如权利要求4所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的RMA扩增反应试剂的配比如下：








试剂
终浓度


Tris
50mM


醋酸镁
100mM

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【专利技术属性】
技术研发人员：陈大为，陈龙，李佳慧，张瑶，孙玉凤，
申请(专利权)人：济南国益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37