用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了用于高效检测新型冠状病毒的RAA‑CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法，所述引物组为包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5的核酸序列，或与其同源性大于90％的核酸序列；方法包括，采用进行新型冠状病毒的核酸扩增；向扩增后的产物中加入crRNA、T7转录酶、NTP、探针和缓冲液制成检测液；检测所述检测液的荧光强度，根据荧光曲线判断样品中是否含有新型冠状病毒；本发明专利技术提供了可代替荧光PCR方法，成为更加廉价、高效、应用范围广的检测新型冠状病毒的方法、扩增引物及试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)传播方式多样。目前已有证据表明，新型冠状病毒的传播方式包括飞沫传播和接触传播等。而动物及其产品在运输、屠宰、加工和储存等过程中被新型冠状病毒感染或者污染的可能性极大。现有研究认为新型冠状病毒来源于蝙蝠，也有证明穿山甲体内发现的冠状病毒与SARS-CoV-2的相似性高达85.5％-92.4％，穿山甲也被认为是SARS-CoV-2的中间宿主。可见，SARS-CoV-2具有广泛的宿主，是一种新发现、传染性强、危害大的人兽共患性传染病。新型冠状病毒目前的检测方法主要是基于PCR方法检测病毒的核酸以及免疫学方法检测患者的抗体。但是PCR和实时荧光PCR需要特定温度循环的扩增仪器，不便于实现现场检疫。目前应用广泛的恒温扩增技术如环等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)与重组酶介导等温核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification)等可以满足现场检测的需求。但是也有证明LAMP存在特异性方面的缺陷，容易导致假阳性。张锋等也证明，重组酶介导等温核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification，RAA)对引物的设计非常敏感，需要从多对引物中筛选才能达到高灵敏度检测的要求。此外，血清学检测方法也有一定的局限性。目前血清学检测方法是检测患者感染早期血清中的IgM或IgG，但是也有研究证明IgM通常在感染5天以后出现，IgG通常在感染10天以后出现，并且感染的早期抗体水平比较低，容易出现漏检或者非特异性结合。因此，目前确诊仍然需要通过荧光PCR方法。但是荧光PCR需要价格昂贵的荧光PCR仪，且检测环境要求高。不利于大范围推广。因此，现有技术还缺少一种高效、低成本、操作便捷的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测试剂盒及其方法。猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒科、冠状病毒属。到目前为止，还没有发现本病毒有不同的血清型。本病毒对乙醚、氯仿敏感。病毒粒子呈现多型性，倾向圆形，外有囊膜。从患病仔猪的肠灌液中浓缩和纯化的病毒不能凝集家兔、小鼠、猪、豚鼠、绵羊、牛、马、雏鸡和人的红细胞。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染可导致猪传染性胃肠炎，该病是一种急性、接触性传染病，TGEV可引起仔猪肠黏膜上皮细胞发生变性、死亡，造成肠道水、电解质代谢紊乱，营养吸收障碍，从而引起仔猪腹泻、脱水、营养流失、甚至死亡。猪传染性胃肠炎主要呈地区性流行，各个品种及不同年龄段猪均对本病易感，但最主要的发病群体是新生仔猪。调查发现对两周龄以下仔猪的致死率高达100％。犬冠状病毒(CCV)为单链RNA病毒，有6～7种多肽，其中4种是糖肽，其不含RNA聚合酶及神经氨酸酶，可使犬发生程度不同的胃肠炎症状。特征有频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食等症状。猫冠状病毒(FCV)分为两个生物型，猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和猫肠道冠状病毒(FECV)。FECV在猫肠道中普遍存在，感染FECV的猫可产生轻微的肠道症状，能够自愈，死亡率低。感染FIPV的猫可患致死性疾病FIP，该病以浆膜炎、系统性炎症和肉芽肿样病变为主要特征。火鸡冠状病毒(TCV)属冠状病毒科、日冕冠状病毒属。是单链RNA病毒。可导致火鸡发生急性、高度传染性的疾病。禽传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒属的一个代表种。鸡传染性支气管炎病毒具有很强的变异性，世界上分离出30多个血清型。主要传播方式是病鸟从呼吸道排出病毒，经空气飞沫传染给易感鸟。此外可通过被污染的饲料、饮水、笼具等经消化道传染。过热、严寒、拥挤、通风不好及维生素、矿物质供应不足均可促使本病发生。各种日龄的鸡都易感，但5周龄内的鸡症状较明显，死亡率可达15-19％。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术的缺陷，提供了用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法，其可代替荧光PCR方法，成为更加廉价、高效、应用范围广的方法。本专利技术的第一个方面，提供了一种用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增引物组，所述引物组为包含SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和/或SEQIDNO.4、SEQIDNO.5的核酸序列，或与其同源性大于90％的核酸序列。本专利技术的第二个方面，提供了一种用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术所述的RAA-CRISPR扩增引物组。优选的，所述引物组为包含SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和/或SEQIDNO.4、SEQIDNO.5的核酸序列，或与其同源性大于90％的核酸序列。优选的，所述试剂盒还包括水化缓冲液和醋酸镁。本专利技术的第三个方面，提供了一种高效检测新型冠状病毒的方法，包括采用本专利技术提供的RAA-CRISPR扩增引物组或RAA-CRISPR扩增试剂盒进行新型冠状病毒的核酸扩增。优选的，方法还包括以下步骤：1)向扩增后的产物中加入Cas13a酶、crRNA、T7转录酶、NTP、探针和缓冲液制成检测液；2)检测所述检测液的荧光强度，根据荧光曲线判断样品中是否含有新型冠状病毒。优选的，所述核酸扩增的方法为重组酶介导等温核酸扩增。优选的，重组酶介导等温核酸扩增的条件为：37℃、30min。优选的，步骤1)与步骤2)之间还包括：向扩增后的产物中加入苯酚氯仿纯化扩增产物。优选的，所述荧光强度的检测仪器包括恒温扩增仪、酶标仪中的任意一种。优选的，收集荧光的时间不少于10min。优选的，方法包括以下步骤：1)RAA扩增：按照50μL反应体系，每支冻干粉中加上下游引物各2μL(10μM)，水化缓冲液41.5μL，模板2μL，醋酸镁2.5μL。反应条件为37℃30min。2)扩增产物纯化：将扩增产物分别加入苯酚氯仿后震荡并10000g，离心5min。3)Cas13a酶检测：按照25μL反应体系：Cas13a酶0.5μL、10倍反应缓冲液2.5μL，crRNA1μL，T7转录酶1μL，NTP2μL，探针5μL，RAA产物4.5μL，水8.5μL，反应温度为37℃，采用荧光恒温扩增仪或酶标仪收集荧光90min。优选的，所述方法是非诊断、非治疗目的。本专利技术相对于现有技术具有如下优点：本专利技术提供了基于RAA-Cas13a检测方法的新型冠状病毒检测方法以及扩增新型冠状病毒的引物及试剂盒，降低对荧光PCR检测设备的依赖，丰富临床检测手段，为基于恒温扩增的新型冠状病毒的检测试剂的制备和生产提供参考。附图说明图1为本专利技术实施例2中两组引物RAA扩增产物的琼脂糖电泳结果图；图2为本专利技术实施例2中两组引物RAA扩增产物的Cas13a检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增引物组，其特征在于，所述引物组为包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5的核酸序列，或与其同源性大于90％的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增引物组，其特征在于，所述引物组为包含SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和/或SEQIDNO.4、SEQIDNO.5的核酸序列，或与其同源性大于90％的核酸序列。


2.一种用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的RAA-CRISPR扩增引物组。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括水化缓冲液和醋酸镁。


4.一种高效检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，包括采用权利要求1-3任意一项所述的RAA-CRISPR扩增引物组或RAA-CRISPR扩增试剂盒进行新型冠状病毒的核酸扩增。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛俊欣，李健，熊炜，张强，蒋原，申进玲，黄忠荣，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海;31