一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒。本发明专利技术所研制的B型牛鼻病毒荧光PCR检测试剂盒，包括SEQ ID NO.1‑2的引物和荧光PCR探针，具有特异性强、敏感性高、省时省力的优点。本试剂盒为B型牛鼻病毒的检测、流行病学调查、监测净化等方面提供了相应的技术支持与帮助。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒。
技术介绍
B型牛鼻病毒(BovinerhinitisBvirus，BRBV)是一种新的小RNA病毒，临床上常与牛的呼吸道疫病有关。该病毒流行于美国、瑞典、墨西哥等国家。近年也流行于中国广东省某些奶牛场。B型牛鼻病毒基因组存在遗传多样性，受到外界环境影响大，而且现有的检测方法难以获知真实特异的实验数据，因此有必要研发一种用于检测B型牛鼻病毒的快速PCR试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鉴别B型牛鼻病毒荧光PCR引物。本专利技术的目的在于提供一种鉴别B型牛鼻病毒荧光PCR检测方法。本专利技术的目的在于提供一种鉴别B型牛鼻病毒荧光PCR试剂盒。文献报道中，记载的B型牛鼻病毒遗传序列较少，相对完整的遗传序列只有9条，但相互间相似性不高，这些序列对于引物设计的广谱性要求很高，设计难度大。如图1所示，9条完整的B型牛鼻病毒编码蛋白序列的相似性比对结果显示，相似性中位数为81.35％，平均数83.21％。根据现有报道的缺陷，申请人针对全长序列设计了两组引物，事后通过比对发现其引物结合位点对应的B型牛鼻病毒的序列一致性较低，如图2所示，变异位点过于密集，无法设置简并碱基。再经过重新筛选，最终选出本专利技术相对保守的序列进行引物设计，并遵循简并碱基尽可能少、尽可能分散，且保证单条引物或探针与上述9条序列中任意序列错配不超过2个碱基的原则，适当设置简并碱基。图3为本方法筛选出来的引物、探针与9条序列的匹配度。本专利技术提供了一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR扩增引物，所述引物的核苷酸序列为：BRBV-F:CGTGGCACACTTCAGGAG；BRBV-R:GTGTACCCAYCTCARACGAAG。本专利技术的又一方面，提供了一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR探针，所述探针的核苷酸序列为：BRBV-probe：TRGCRGGTCTCGCTTTYCACAGT。根据本专利技术的实施例，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，探针序列3’端的淬灭基团为BHQ1。本专利技术的又一方面，提供了一种检测B型牛鼻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的引物和荧光PCR探针。根据本专利技术的实施例，还包括OneStepPrimeScriptIIIRT-qPCRMix、阳性对照和阴性对照。本专利技术的又一方面，提供了一种检测B型牛鼻病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的RNA；(2)以提取的RNA为模板，用前面所述引物组、荧光PCR探针进行荧光PCR扩增，获得扩增曲线；(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，判断样品中是否有B型牛鼻病毒；该检测方法不适用于疾病的诊断与治疗。根据本专利技术的实施例，步骤(2)中所述的扩增体系为：引物BRBV-F2.0μL，引物BRBV-R2.0μL，探针BRBV-probe1.5μL，OneStepPrimeScriptIIIRT-qPCRMix(2×)12.5μL，ddH2O5.0μL，核酸2.0μL。根据本专利技术的实施例，步骤(2)中所述的扩增程序为：52℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火延伸30s，循环45次。根据本专利技术的实施例，步骤(3)中所述的结果判定：样品出现S曲线且Ct值≦36，判定为B型牛鼻病毒核酸阳性；36<Ct值≦40判定为可疑；Ct值>40或是无Ct值则判定为B型牛鼻病毒核酸阴性。本专利技术的又一方面，提供了前面所述的引物、前面所述探针在制备检测B型牛鼻病毒试剂中的应用。根据本专利技术的实施例，所述检测步骤如下：(1)提取待检样品的RNA；(2)以提取的RNA为模板，用前面所述引物组、荧光PCR探针进行荧光PCR扩增，获得扩增曲线；(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，判断样品中是否有B型牛鼻病毒。本专利技术的有益效果是：本专利技术的检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒，可用于B型牛鼻病毒的检测。具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。能够为B型牛鼻病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。而且有助于B型牛鼻病毒精准检测，便于养牛场开展B型牛鼻病毒的监测净化，进而促进养牛业健康发展，为B型牛鼻病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。附图说明图1是九条公开的B型牛鼻病毒基因间的相似性比对。图2是九条公开的B型牛鼻病毒基因的相似性分析结果。图3是本专利技术的B型牛鼻病毒荧光PCR检测引物与探针的匹配性。图4是B型牛鼻病毒荧光PCR检测试剂盒临床样品检测结果；曲线①：B型牛鼻病毒阳性对照；曲线②、③：临床阳性样品。图5是B型牛鼻病毒荧光PCR检测试剂盒特异性试验结果；曲线①：B型牛鼻病毒阳性对照扩增曲线；曲线②：口蹄疫病毒、塞内卡病毒、边界病毒、牛病毒性腹泻病毒、D型流感病毒的扩增曲线。图6是B型牛鼻病毒荧光PCR检测试剂盒敏感性试验结果；曲线①-分别为阳性质粒的101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍、1011倍的倍比稀释结果。具体实施方式材料：B型牛鼻病毒阳性重组质粒取自广东省农业科学院动物卫生研究所。口蹄疫病毒、塞内卡病毒、D型流感病毒取自广东省农业科学院动物卫生研究所。此外，边界病毒毒株、牛病毒性腹泻阳性毒株由江苏省农业科学院兽医研究所毛立博士馈赠。试剂：OneStepPrimeScriptIIIRT-qPCRMix(2×)试剂等购自宝日医生物技术(北京)有限公司、双蒸水等购自天根生化科技(北京)有限公司。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1根据B型牛鼻病毒基因序列，经过大量筛选设计出，能够扩增B型牛鼻病毒基因序列的引物对BRBV-F和BRBV-R，以及TaqMan探针，其碱基序列如下所示BRBV-F:CGTGGCACACTTCAGGAG(SEQIDNO:1)；BRBV-R:GTGTACCCAYCTCARACGAAG(SEQIDNO:2)。BRBV-probe:FAM-TRGCRGGTCTCGCTTTYCACAGT-BHQ1(SEQIDNO:3)。BRBV-probe的5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为BHQ1。实施例2(1)人工合成B型牛鼻病毒靶基因序列，连接至载体上，将重组的载体DNA作为阳性质粒，进行PCR扩增。同时以ddH2O作为阴性对照。(2)以制备的阳性质粒，用实施例1引物组BRBV-F、BRBV-R和探针BRBV-probe在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行荧光PCR扩增，扩增体系为：...

【技术保护点】
1.一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR扩增引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：/nBRBV-F:CGTGGCACACTTCAGGAG；/nBRBV-R:GTGTACCCAYCTCARACGAAG。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR扩增引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
BRBV-F:CGTGGCACACTTCAGGAG；
BRBV-R:GTGTACCCAYCTCARACGAAG。


2.一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：BRBV-probe：TRGCRGGTCTCGCTTTYCACAGT。


3.根据权利要求2所述的荧光PCR探针，其特征在于，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，探针序列3’端的淬灭基团为BHQ1。


4.一种检测B型牛鼻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1的引物和权利要求2或3的荧光PCR探针。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括OneStepPrimeScriptIIIRT-qPCRMix、阳性对照和阴性对照。


6.一种检测B型牛鼻病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待检样品的核酸；
(2)以提取的核酸为模板，用权利要求1的引物组、权利要求2或3的荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟少伦，谢逸伦，翟颀，吕殿红，魏文康，温肖会，贾春玲，周秀蓉，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44