一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物及扩增测序方法技术

本发明专利技术公开了一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物及扩增测序方法。本申请采用三段式扩增策略，分析并选取三个扩增目的片段，第一个扩增子是gag‑pol扩增子，第二个扩增子是pol‑env扩增子，第三个扩增子是env‑nef扩增子，针对上述三个扩增子通过设计和筛选引物，最终获得了艾滋病病毒近全长基因组。本发明专利技术的方法适用于HIV‑1B和BC毒株的近全长基因组扩增和测序，三扩增子策略的扩增效率达到65.6％，扩增后可获得75％的艾滋病病毒基因组序列，满足了我国HIV主要流行毒株的研究需求。

【技术实现步骤摘要】
一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物及扩增测序方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物及扩增测序方法。
技术介绍
人免疫缺陷病毒(HIV)可感染人类免疫系统，最终导致免疫缺陷发生，是全球性的公共卫生问题。HIV病毒基因组测序对研究HIV病毒的流行及分子进化提供了有力的数据支持。国际上已有的几种近全长HIV-1测序的RT-PCR方法可能仅限于某些流行株，HIV-1不同亚型的构成和不同遗传特性需要不同的全基因组制备方案，而现今没有针对中国特异流行毒株测序方法，这对中国HIV-1的研究带来了严峻挑战。同时，由于HIV病毒变异速率高，造成了全长扩增的困难，多数会借助质粒扩增的方法，方法繁琐，也很难测得HIV基因组全长序列。因此，本领域亟需开发一种方便、快速，并适用于国内大多数实验室检测中国HIV-1主要流行株的通用技术，以期解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述的技术问题，而提供一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物及扩增测序方法。本专利技术是按照以下技术方案实现的：一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物，包括以下引物序列：gag-pol外套上游引物序列如SEQIDNO.1所示；gag-pol外套下游引物序列如SEQIDNO.2所示；gag-pol内套上游引物序列如SEQIDNO.3所示；gag-pol内套下游引物序列如SEQIDNO.4所示；pol-env外套上游引物序列如SEQIDNO.5所示；pol-env外套下游引物序列如SEQIDNO.6所示；pol-env内套上游引物序列如SEQIDNO.7所示；pol-env内套下游引物序列如SEQIDNO.8所示；env-nef外套上游引物序列如SEQIDNO.9所示；env-nef外套下游引物序列如SEQIDNO.10所示；env-nef内套上游引物序列如SEQIDNO.11所示；env-nef内套下游引物序列如SEQIDNO.12所示。一种从血浆中直接扩增测序艾滋病病毒基因组的方法，包括以下步骤：a.样本处理：分离样本血浆，检测样本的病毒拷贝数，选取5000-120000拷贝/ml的样本；b.RNA抽提：对血浆中的HIV-1RNA进行抽提；c.反转录：将抽提的HIV-1RNA反转录成cDNA；d.PCR扩增：采用三段式扩增，使用权利要求1中的引物，从合成的cDNA中扩增HIV-1基因组；e.测序。进一步的，步骤d中，PCR扩增分两轮进行，第一轮PCR反应体系如下：进一步的，第一轮PCR反应条件为：94℃2min热变性，1个循环；96℃10s，68℃1min/kb，15个循环；95℃10s，68℃1min/kb+5s/循环，15个循环；68℃15min。进一步的，第二轮PCR反应体系如下：进一步的，第二轮PCR反应条件为：94℃2min热变性，1个循环；96℃10s，68℃1min/kb，15个循环；95℃10s，68℃1min/kb+5s/循环，15个循环；68℃20min。本专利技术具有的优点和有益效果是：本专利技术的方法适用于HIV-1B和BC毒株的近全长基因组扩增和测序。本专利技术采用的三扩增子策略的扩增效率为65.6％，对比传统使用的单片段扩增子策略(约为25％)扩增效率有明显提高。同时，三扩增子策略在测序方面优势明显，单片段扩增策略时DNA测序没有获得完整的近全长的基因组序列，而使用三扩增子策略可获得75％的序列。另外，本专利技术方法不需要超速离心步骤，适用于国内的大多数实验室，并能以较高的效率直接从血浆中获得病毒基因组。扩增时采用PCR阳性时的最高稀释度cDNA，可以确保测序反应使用的是单个模板，减少层析图谱中的重叠峰。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的说明。本专利技术在已发表的HIV全基因组测序的基础上，通过全基因序列分析及比对，优化设计了适合中国国内流行毒株基因扩增和测序的通用引物，并对病毒RNA提取和基因扩增方法进行了改进和优化，使其能在国内大多数实验室原有设备的基础上进行应用。从HIV数据库中选取M群的不同HIV-1，比对后选取最保守的区域作为引物结合位点，扩增长度与目的片段的保守度相关，最大的gag-pol扩增片段代表了HIV-1最保守的基因区域，而高可变的env基因被分为两个片段(pol-env和env-nef)进行扩增。将筛选出的引物与中国HIV-1主要流行毒株B和BC进行了进一步比对，引物的结合位点避开了BC重组株的重组断裂点，引物设计中的简并碱基用于覆盖引物结合位点的遗传多样性。以满足研究我国HIV主要流行毒株得研究需求。三段式扩增策略：第一个扩增子是gag-pol扩增子(nts623-4925HXB2),第二个扩增子是pol到env扩增子(nts4743-7668HXB2)，第三个扩增子是env到nef扩增子(nts6996-9635HXB2)。具体引物序列信息参见表1。表1近全长RT-PCR设计：用SuperScriptTMIIIRNaseH2RT，用引物1.3MR将病毒RNA反转录成cDNA。采用三扩增子策略扩增近全长基因组：分别为4.3kb(gag-pol)、2.9kb(pol-env)和2.7kb(env-nef)。具体步骤如下：(1)样本处理：分离样本血浆，用AmplicorVersion1.5assay(Roche,Durham,NC,USA)检测每个样本的病毒拷贝数，选取5000-120000拷贝/ml的样本。(2)RNA抽提：按照说明书，使用QIAmpDNABloodMidiKit(QIAgen,Germany)试剂盒对血浆中的HIV-1RNA进行抽提。每1ml血浆样本可得到120ul的RNA。(3)反转录：使用SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSupermix(Invitrogen,USA)试剂盒进行cDNA合成。按照说明书合成cDNA，已合成的cDNA可储存于-20℃中。反应体系及反应条件如下：RT反应体系一：在PCR仪上先预热至65度，5min，再冷至45度，加入反应体系二。RT反应体系二：反应条件：反应体系一和二混合后，45℃，90min；加入1μl反转录酶，继续反应45℃90min；70℃，10min后加入1μlRNaseH，37℃，20min。取出置4℃，用于PCR扩增。(4)PCR扩增：使用ExpandHighFidelityPCRSystem(RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,Germany)从合成的cDNA中扩增HIV-1基因组。进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物，其特征在于：包括以下引物序列：/ngag-pol外套上游引物序列如SEQ ID NO.1所示；/ngag-pol外套下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；/ngag-pol内套上游引物序列如SEQ ID NO.3所示；/ngag-pol内套下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；/npol-env外套上游引物序列如SEQ ID NO.5所示；/npol-env外套下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；/npol-env内套上游引物序列如SEQ ID NO.7所示；/npol-env内套下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；/nenv-nef外套上游引物序列如SEQ ID NO.9所示；/nenv-nef外套下游引物序列如SEQ ID NO.10所示；/nenv-nef内套上游引物序列如SEQ ID NO.11所示；/nenv-nef内套下游引物序列如SEQ ID NO.12所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物，其特征在于：包括以下引物序列：
gag-pol外套上游引物序列如SEQIDNO.1所示；
gag-pol外套下游引物序列如SEQIDNO.2所示；
gag-pol内套上游引物序列如SEQIDNO.3所示；
gag-pol内套下游引物序列如SEQIDNO.4所示；
pol-env外套上游引物序列如SEQIDNO.5所示；
pol-env外套下游引物序列如SEQIDNO.6所示；
pol-env内套上游引物序列如SEQIDNO.7所示；
pol-env内套下游引物序列如SEQIDNO.8所示；
env-nef外套上游引物序列如SEQIDNO.9所示；
env-nef外套下游引物序列如SEQIDNO.10所示；
env-nef内套上游引物序列如SEQIDNO.11所示；
env-nef内套下游引物序列如SEQIDNO.12所示。


2.一种从血浆中直接扩增测序艾滋病病毒基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.样本处理：分离样本血浆，检测样本的病毒拷贝数，选取5000-120000拷贝/ml的样本；
b.RNA抽提：对血浆中的HIV-1RNA进...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟哲峰，杜玲，
申请(专利权)人：上海市闵行区中心医院，
类型：发明
国别省市：上海;31