一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物以及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物及包含该引物的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，所述反应液的由包括以下溶液混合而成：20 mM Tris‑HCl，10 mM KCl，10 mM（NH4）

【技术实现步骤摘要】
一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物以及试剂盒
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物以及试剂盒。
技术介绍
猪流行性腹泻，英文缩写为PED(PorcineEpidemicDiarrhea)，是由猪流行性腹泻病毒引起的一种接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水。该病毒的检测如果采用现有的PCR技术，由于其反应要在2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且PCR技术仅仅1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。而LAMP技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷提供一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物及试剂盒。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物，具体为：PEDV-F3：GCTTCAAATGTGACGGGTT；PEDV-B3：CTAAACAAAGCCTGCCAAT；PEDV-FIP：GCTGCCAACATAATATAATTGCGC-CACCAGTGTTTTTGTTTACTTCT；PEDV-BIP：GCGTTTTGCTGTCGTCTTTCTC-CGCAACAAATAATAGTTGCATCT。本专利技术提供一种高效检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，18μL所述反应液的由包括以下溶液混合而成：20mMTris-HCl，10mMKCl，10mM（NH4）2SO4，8mMMgSO4，0.1%Tween-20，1.4mMdNTPs，8000U/mLBst酶，25nMSYTO-9荧光染料，纳米金颗粒。20mMTris-HCl3.5μL；10mMKCl2μL；10mM（NH4）2SO42μL；8mMMgSO42μL；0.1%Tween-202μL；1.4mMdNTPs2.5μL；8000U/mLBst酶2μL；25nMSYTO-9荧光染料1μL；纳米金颗粒1μL。所述引物的浓度和体积为：PEDV-F3：100μM0.01μL；PEDV-B3：100μM0.01μL；PEDV-FIP：100μM0.08μL；PEDV-BIP：100μM0.08μL。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔和第2检测孔各包埋扩增猪流行性腹泻病毒序列的引物，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒，冻干。所述猪流行性腹泻病毒的核酸序列为SEQNO.1:ATGTAGTTCCAATTAGACAAGCTTCAAATGTGACGGGTTTTCTTTTCACCAGTGTTTTTGTTTACTTCTTTGCACTGTTTAAAGCGTCTTCTTTGAGGCGCAATTATATTATGTTGGCAGCGCGTTTTGCTGTCGTCTTTCTCTATTGCCCACTTTTATATTACTGTGGTGCACTTTTAGATGCAACTATTATTTGTTGCGCACTTATTGGCAGGCTTTGTTTAGTCTGCTTTTACTCCTGGCGCTATAAAAATGCGCTTTTTATTATCTTTAATACTACGACACTTTCTTTTCTCAATGGTAAAGCAGCTTATTATGACGGCAAATCCATTGTGATTCTAGAAGGTGGCGACCATTACATCACTTTTGGCAACTCTTTTGTTGCTTTCGTTAGTAACATTGACTTGTATCTAGCTATACGTGGGCGGCAAGAAGCTGACCTACATCTGTTGCGAACTGTTGAGCTTCTTGATGGCAAGAAGCTTTATGTCTTTTCGCA。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便。附图说明图1为实施例中检出限的验证的扩增结果示意图。图2为实施例中重复性的验证的扩增结果示意图。图3为实施例中特异性的验证的扩增结果示意图。具体实施方式实施例先通过NCBIGenBank寻找目标序列，并针对目标序列设计引物，并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装，与从猪肉及其各种脏器、血液、排泄物、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后，加入到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪中，上述仪器和芯片均为市售产品，宁波爱基因科技有限公司也有相应公开产品，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观的反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有PEDV。具体的操作步骤如下：微流控芯片检测体系中18μL反应液的组成如下：20mMTris-HCl（pH8.8），10mMKCl，10mM（NH4）2SO4，8mMMgSO4，0.1%Tween-20，1.4mMdNTPs，8000U/mLBstDNApolymerase，25nMSYTO-9荧光染料，1μL纳米金颗粒。20mMTris-HCl3.5μL；10mMKCl2μL；10mM（NH4）2SO42μL；8mMMgSO42μL；0.1%Tween-202μL；1.4mMdNTPs2.5μL；8000U/mLBst酶2μL；25nMSYTO-9荧光染料1μL；纳米金颗粒1μL。所述引物的浓度和体积为：其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔和第2检测孔各包埋扩增猪流行性腹泻病毒序列的引物，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒，冻干。所述猪流行性腹泻病毒的核酸序列为SEQNO.1：ATGTAGTTCCAATTAGACAAGCTTCAAATGTGACGGGTTTTCTTTTCACCAGTGTTTTTGTTTACTTCTTTGCACTGTTTAAAGCGTCTTCTTTGAGGCGCAATTATATTATGTTGGCAGCGCGTTTTGCTGTCGTCTTTCTCTATTGCCCACT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物，其特征在于，具体为：/nPEDV-F3：GCTTCAAATGTGACGGGTT；/nPEDV-B3：CTAAACAAAGCCTGCCAAT；/nPEDV-FIP：/nGCTGCCAACATAATATAATTGCGC-CACCAGTGTTTTTGTTTACTTCT；/nPEDV-BIP：/nGCGTTTTGCTGTCGTCTTTCTC-CGCAACAAATAATAGTTGCATCT。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效检测猪流行性腹泻病毒的引物，其特征在于，具体为：
PEDV-F3：GCTTCAAATGTGACGGGTT；
PEDV-B3：CTAAACAAAGCCTGCCAAT；
PEDV-FIP：
GCTGCCAACATAATATAATTGCGC-CACCAGTGTTTTTGTTTACTTCT；
PEDV-BIP：
GCGTTTTGCTGTCGTCTTTCTC-CGCAACAAATAATAGTTGCATCT。


2.一种高效检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，所述反应液的由包括以下溶液混合而成：20mMTris-HCl，10mMKCl，10mM（NH4）2SO4，8mMMgSO4，0.1%Tween-20，1.4mMdNTPs，8000U/mLBst酶，25nMSYTO-9...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢先东，刘艳红，贺磊，
申请(专利权)人：宁波爱基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33