一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括核酸提取试剂盒和核酸扩增试剂盒，其中核酸提取试剂盒采用磁珠法对样本进行快速核酸裂解吸附，核酸扩增试剂盒采用荧光定量RT‑PCR技术进行定量分析，同时设计了最合适的引物和探针序列，并采用了含有SARS‑CoV‑2和HCV基因片段的假病毒作为标准品，通过具备国际标准品的HCV来定标检测假病毒原液SARS‑CoV‑2病毒含量，非常准确表征标准品的拷贝数，克服了荧光PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性，进一步提升了新型冠状病毒核酸检测效果，提高了检测灵敏度。本发明专利技术提供的定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒具有较高的灵敏度和特异性、能精确定量新型冠状病毒拷贝数，操作简便，结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒
本专利技术属于分子诊断生物学
，涉及一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒。
技术介绍
近日关于新冠肺炎无症状感染者是否引发我国疫情反弹，成为社会广泛关注的热点问题。部分重型、危重型COVID-19患者经治疗后病情好转，但往往因高龄、免疫功能低下、结构性肺病，或由于病情严重致肺部纤维化导致肺部结构改变，造成血液循环灌注不全面，导致部分隐藏的病毒未完全被清除，或者细胞仍为带毒状态，但机体排毒量尚未达到核酸检测阳性所需的病毒量，若此时机体免疫力低下，未被完全杀死的病毒可能复发、再燃，导致病情反复。因此在临床中，检测患者体内SARS-CoV-2载量很有必要。随着近年来分子生物学诊断技术迅猛发展，荧光定量PCR技术成为传染病病原基因诊断方法中越来越受到关注的一种重要手段。荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术，是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，其中以TaqMan探针法标记的FQ-PCR技术应用最广泛。该技术克服了传统检测技术由于样品病原含量较低带来的检测难度，在数小时内即可确定传染病病原体的种类，具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单、自动化程度高、防污染并且高通量、快速等特点，现已广泛应用于人类和动物传染性疾病的定性定量检测。在RNA病毒的RT-PCR检测中，影响试验过程的因素较多，如操作误差、设备误差、试剂差异、样本本身的处理差异，均可能会造成试验结果的不同，可能还有假阴、阳性出现。因此，RT-PCR测定必须使用质控品进行严格的质量控制，才能保证结果的可靠性。此外，进行定量测定，必须有定量的标准品或内标。由于天然病毒潜在的传染危险性及其RNA分子的不稳定性，目前应用的质控品如灭活的病毒颗粒、cDNA、质粒DNA、裸露的RNA以及体外转录RNA，都难以达到试验要求，所以研制稳定可靠、无生物传染性的质控物和标准品，不但对RNA病毒的RT-PCR检测，而且对商品化的病毒RT-PCR试剂盒的评价都具有重要意义。在这样的背景下，通过假病毒包装技术制备标准品将会是一种非常安全可靠的研究手段。假病毒(pseudotypevirus)，是指种病毒拥有自己的遗传物质，囊膜上却包被有另一种病毒的糖蛋白，因而具有了另一种病毒的感染特征。假型病毒与提供囊膜蛋白的真病毒一样，对宿主细胞有同样的侵染性。这种基因型和表现型不一致的现象叫假型，具有这种特征的病毒叫假病毒，这种病毒只能进行“一个细胞周期”的侵染，生物安全性比较强。以逆转录病毒载体为基础，将要包装的外源基因结合报告基因通过转染，将外源基因整合到宿主细胞基因组中实现稳定表达(建立细胞系)或瞬时表达的目的。通过逆转录病毒的复制，以及载体提供的包装信号，即可得到一种外源基因被逆转录病毒衣壳包裹的复制缺陷型的假病毒颗粒。使用内含目的RNA的假病毒颗粒作为RNA病毒荧光定量RT-PCR检测的质控品和标准品不仅无生物传染危险性，而且在核酸提取中，对病原体内RNA有很好的模拟作用，同时假病毒RNA不易对实验仪器和环境造成交叉污染而导致假阳性结果，避免了以往研制的商品化试剂盒中常用质粒标准品不能很好地对样品进行处理及对逆转录过程进行有效控制的问题。因此作为试剂盒的阳性参考品，构建一种可以模拟病毒从RNA至核酸扩增全过程的阳性参考品是一种很好的解决方法。CN111378785A公开了采用新型冠状病毒的RdRp、GeneE和GeneN基因构建的假病毒作为标准品，并采用q-PCR进行定量检测新型冠状病毒，但由于SARS-CoV-2目前尚没有国际标准品，因此采用含有SARS-CoV-2基因的假病毒仍然难以精确定量新型冠状病毒拷贝数；由于还需提取假病毒的RNA，反转录成DNA，再进一步进行PCR反应；另外还需要利用CDC和WHO的引物、探针的检测体系，对假病毒的目的基因拷贝数开展ddPCR的绝对定量，进而用于核酸诊断2019-nCoV的试剂盒的性能评价中，为检测过程带来了很多不便，但定量的新型冠状病毒拷贝数仍存在不够精确的风险。目前市面的COVID-19核酸检测试剂盒的核酸提取过程复杂，耗时长，灵敏度低，难以精确定量新型冠状病毒拷贝数。而且目前还没有关于新型冠状病毒的磁珠核酸提取和RT-PCR定量检测，精确定量新型冠状病毒拷贝数的试剂盒的相关报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种高灵敏度和特异性、能精确定量新型冠状病毒拷贝数的新型冠状病毒RT-PCR定量检测试剂盒。该试剂盒在实践中既可以对感染SARS-CoV-2病毒的人群进行早期临床诊断，也可以对病人的治疗情况进行定量检测，效果极为良好。本专利技术采用磁珠法对样本进行快速核酸裂解吸附，并采用荧光定量RT-PCR技术，即通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中的初始模板进行定量分析，同时设计了最合适的引物和探针序列，并采用了含有COVID-19和HCV基因片段的假病毒作为标准品，通过具备国际标准品的HCV来定标检测，进一步提升了新型冠状病毒核酸检测效果，提高了检测灵敏度。由于采用磁珠法提取新型冠状病毒核酸的过程中，受磁珠吸附核酸效率和磁珠碰撞效率的影响，更适用于微量核酸的提取；定量RT-PCR可实时检测产物量，通过加入已知浓度的假病毒标准品绘制标准曲线，然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度。它操作简便，结果准确可靠，是一种新的临床检测方法。一方面，本专利技术提供了含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品用于制备定量检测新型冠状病毒拷贝数试剂盒的用途。进一步地，所述假病毒标准品的基因含有由SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区以及HCV保守区基因序列串联并合成的目标基因CoV/HCVRNA，CoV/HCVRNA的序列如序列表中SeqIDNO.10。经过实验证明，选用自新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因的序列片段，并设计合适的的引物和探针，进行新型冠状病毒核酸提取检测时，能够明显提高检测灵敏度。假病毒标准品中串联有HCV保守区基因，可通过具备国际标准品的HCV来定标检测假病毒原液SARS-CoV-2病毒含量，从而非常准确表征标准品的拷贝数。进一步地，所述假病毒标准品的制备方法为：1)将MS2噬菌体、SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区、HCV的保守区基因序列串联并合成目标基因MS2-CoV/HCV；2)将MS2-CoV/HCV基因插入原核表达载体pET-28b中，构建pET-28b-MS2-CoV/HCV重组质粒；3)将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒并双酶切鉴定，经IPTG诱导培养后经SDS-PAGE鉴定表达情况，纯化后得到CoV/HCVRNA；其中，ORF1ab保守区基因序列如SeqIDNO.7所示，N保守区基因序列如SeqIDNO.8所示，HCV保守区基因序列如SeqIDNO.9所示，MS2-CoV/HCV、pET-28b-MS2-CoV/HCV的序列如序列表中SeqIDNO.11、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品用于制备定量检测新型冠状病毒拷贝数试剂盒的用途。/n

【技术特征摘要】
1.含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品用于制备定量检测新型冠状病毒拷贝数试剂盒的用途。


2.一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品。


3.一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两组引物和探针，所述两组引物和探针分别为：
第一组
对应于ORF1ab基因的正向引物的序列如序列表中SeqIDNO.1所示；
对应于ORF1ab基因的反向引物的序列如序列表中SeqIDNO.2所示；
对应于ORF1ab基因的探针序列如序列表中SeqIDNO.3所示；
第二组
对应于N基因的正向引物的序列如序列表中SeqIDNO.4所示；
对应于N基因的反向引物的序列如序列表中SeqIDNO.5所示；
对应于N基因的探针序列如序列表中SeqIDNO.6所示。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品。


5.如权利要求2或4所述的试剂盒，其特征在于，所述假病毒标准品的基因含有由SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区以及HCV保守区基因序列串联并合成的目标基因CoV/HCVRNA；
其中ORF1ab保守区基因序列如SeqIDNO.7所示，N保守区基因序列如SeqIDNO.8所示，HCV的保守区基因序列如SeqIDNO.9所示，CoV/HCVRNA的序列如序列表中SeqIDNO.10。


6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述假病毒标准品的制备方法为：
1)将MS2噬菌体、SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区、HCV的保守区基因序列串联并合成目标基因MS2-CoV/HCV；
2)将MS2-CoV/HCV基因插入原核表达载体pET-28...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕建新，赵丹蕊，郭兴中，陈文，孙艳，刘松林，陶晔琪，陈小英，方剑秋，
申请(专利权)人：杭州丹威生物科技有限公司，杭州医学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33