一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法。所述crRNA组合同时靶向耳聋基因GJB2和SLC26A4的5个SNP位点，包括SEQ ID No.2、4、6、8、10所示的核苷酸序列。采用的遗传性耳聋多重检测试剂盒将Cas12a检测反应体系设置在孔板的微孔内，多重RPA扩增在镂空蜂巢芯片中进行，使用中空垫圈把镂空版蜂巢芯片和微孔底部进行物理隔离，从而将多重RPA扩增与Cas12a检测两个反应先进行隔离，再进行融合，实现了一步法、多重检测，也避免了开盖检测可能造成的气溶胶污染。本发明专利技术还实现了高通量检测，一次反应最多检测96个样本、同时区分5个SNP位点，适用于大规模遗传筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法
本专利技术涉及生物检测
，特别是针对SNP检测领域，具体涉及一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas12a的遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法。
技术介绍
耳聋是临床常见的听力神经系统缺陷性疾病，遗传和环境因素均可致病，其中遗传因素约占60％(MortonCC,etal.,2006,NEnglJMed,354(20):2151–2164)，经人类研究发现的耳聋致病基因有100余种(http://hereditaryhearingloss.org/)，但发病主要集中在GJB2、SLC26A4、12srRNA、GJB3等几个基因的热点突变上。据统计，在中国听力残疾人群2000多万，7岁以下聋儿达80万，每年新增聋儿3万余名，发病率为1～3‰，属于稀有突变/SNP(LiL,etal.,2012,Chin.J.Otol,10(2):246-251)。遗传筛查通常是对人群中的“稀有突变/SNP”进行大规模的检测，检测结果绝大部分都是野生型，但现有方法仍对每个人从头至尾进行检测，造成了极大的人力、物力和资源的浪费，缺乏能够在一开始就对遗传性耳聋的多个位点是否含有突变进行初筛的多重SNP检测方法。现有的耳聋基因突变检测方法总结如下：(1)限制性片段长度多态性分析(RFLP)根据酶切图谱进行检测，成本低，只需简单的仪器，但操作繁琐、费时费力、检出率较低(DaiP,etal.,2007,GenetMed,9(5):283–289)；(2)Taqman探针法和高分辨熔解曲线(HRM)分别将荧光探针和饱和染料与PCR结合进行实时监测，操作简化，时间缩短，但依赖高分辨率的定量PCR仪，并且很难实现多重检测(IwasaYI,2016,PLoSOne,11(12):e0166781；MercerS,etal.,2011,GenetTestMolBiomarkers,15(5):365–368)；(3)测序法作为分子生物学诊断的金标准，准确率极高，但需要测序仪和专业操作，一般仅用于发现新的SNP突变位点(ShearerAE,etal.,2010,ProcNatlAcadSci,107(49):21104–21109)；(4)质谱法和数字PCR因其高灵敏度也被用于耳聋突变检测，但前者依赖质谱仪、步骤多耗时长，后者依赖数字PCR仪、试剂耗材贵，均不适用于大规模的遗传筛查(PengQ,etal.,2016,GenetTestMolBiomarkers,20(10):603–608；FangWang,etal.,2018,AnalChem,90(15),8919-8926)。因此，基因芯片凭借其可同时检测大量序列(多重检测)、简单快速、成本低、高灵敏度和特异性的优点，成为耳聋突变遗传筛查的主流方法(LiCX,etal.,2008,HumMutat,29(2):306–314；DaiP,etal.,2019,AmJHumGenet,105(4):803–812)。北京博奥生物利用耳聋基因芯片完成了全国269.91万新生儿的基因筛查(http://cn.capitalbio.com/gxba/xwzx/gsxw/2018nyjd/26885.shtml)，检出新生儿耳聋突变携带率约为4～5％，但该方法的不足之处在于依赖芯片扫描仪和PCR热循环仪，受限于多重PCR引物对之间的干扰，扩增需要分两管进行，芯片杂交步骤可能造成气溶胶污染，且很难实现高通量检测，不利于快速高效地大规模遗传筛查。CRISPR/Cas12a属于Cas酶的第二家族，能够与crRNA结合形成二元复合物，并在其引导下扫描双链DNA，识别TTTN的PAM序列，形成Cas12a-crRNA-dsDNA三元复合物，激活Cas12a的顺式切割活性，特异性地切割dsDNA，进而诱导产生强大的反式切割活性，非特异性地切割ssDNA(ChenJS,etal.,2018,Science,360(6387):436–439；LiSY,2018,CellRes,28(4):491–493)，所以只需在体系中加入荧光探针ssDNAreporter，就能通过荧光强度的变化区分单碱基突变，对于不含PAM序列的检测位点可以通过PCR、RPA、LAMP等扩增方式引入。现有专利文献CN110878343A公开了一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1(Cas12a)试剂盒及检测方法，但它的RPA扩增与Cas12a检测分两步进行，开盖检测容易造成气溶胶污染，并且无法实现多个位点的同时检测，只能逐个进行，通量较低。此外，它只针对SLC26A4一个基因进行设计，覆盖面低。因此，本专利技术致力于将Cas12a的单碱基识别能力、镂空蜂巢芯片的多重检测能力和标准96孔板的高通量特性有效地集成起来，开发一种操作简便、一步法、适用于大规模遗传筛查的高通量和多重SNP检测平台，同时检测GJB2和SLC26A4两个基因的5个突变位点。
技术实现思路
针对现有检测方法的技术问题，本专利技术提供一种基于CRISPR/Cas12a和镂空蜂巢芯片的遗传性耳聋多重检测的crRNA组合、试剂盒及方法。该方法利用Cas12a的顺式和反式切割活性，针对耳聋致病基因GJB2和SLC26A4的5个热点突变设计和筛选crRNA，并结合镂空蜂巢芯片和标准96孔板，构建了一步法、多重crRNA检测体系，同时实现了高通量检测。整个扩增和检测过程处于密闭环境中，避免了气溶胶污染，借助酶标仪在1.5小时内最多可同时检测96个样本、区分5个SNP位点，极大降低了检测成本，在大规模遗传筛查中具有良好的应用前景。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合，包含以下突变型crRNA：用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.176_191del16的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.235delC的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.299_300delAT的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；；用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点c.2168A>G的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.10所示。本专利技术还提供了一种遗传性耳聋多重检测及分型的crRNA组合，包含以下野生型和突变型crRNA组1～5：用于检测遗传性耳聋突变位点GJB2(c.176_191del16)的野生型和突变型crRNA组1由SEQIDNo.1和No.2所示的核苷酸序列组成；用于检测遗传性耳聋突变位点GJB2(c.235delC)的野生型和突变型crRNA组2由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合，其特征在于，包含以下突变型crRNA：/n用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.176_191del16的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；/n用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.235delC的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQID No.4所示；/n用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.299_300delAT的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；；/n用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点c.2168A>G的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；/n用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种遗传性耳聋多重检测的crRNA组合，其特征在于，包含以下突变型crRNA：
用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.176_191del16的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.235delC的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；
用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.299_300delAT的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；；
用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点c.2168A>G的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；
用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G的突变型crRNA，核苷酸序列如SEQIDNo.10所示。


2.一种遗传性耳聋多重检测及分型的crRNA组合，其特征在于，包含以下野生型和突变型crRNA组1～5：
用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.176_191del16的野生型和突变型crRNA组1由SEQIDNo.1和No.2所示的核苷酸序列组成；
用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.235delC的野生型和突变型crRNA组2由SEQIDNo.3和No.4所示的核苷酸序列组成；
用于检测遗传性耳聋GJB2基因突变位点c.299_300delAT的野生型和突变型crRNA组3由SEQIDNo.5和No.6所示的核苷酸序列组成；
用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点c.2168A>G的野生型和突变型crRNA组4由SEQIDNo.7和No.8所示的核苷酸序列组成；
用于检测遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G的野生型和突变型crRNA组5由SEQIDNo.9和No.10所示的核苷酸序列组成。


3.一种遗传性耳聋多重检测反应体系，其特征在于，包括RPA扩增反应体系和Cas12a检测反应体系；所述Cas12a检测反应体系包括权利要求1或2所述的crRNA组合。


4.根据权利要求3所述的遗传性耳聋多重检测反应体系，其特征在于，所述RPA扩增反应体系包括序列如SEQIDNO.11～20所示的RPA引物对。


5.一种遗传性耳聋多重检测试剂盒，其特征在于，包括镂空蜂巢芯片、中空垫圈(3)、孔板(8)和加样头(5)；
所述中空垫圈(3)设置在镂空蜂巢芯片下方，中空垫圈(3)和镂空蜂巢芯片放置于孔板(8)的微孔(4)中；
所述镂空蜂巢芯片包括芯片底座(2)和多根毛细管(1)，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱元首，陶生策，
申请(专利权)人：上海真测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31