一种富集T细胞的方法及其在过继性T细胞治疗中的应用技术

本发明专利技术涉及过继性T细胞免疫疗法技术领域，具体而言，涉及一种富集T细胞的方法及其在过继性T细胞治疗中的应用。该富集方法包括将外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)培养1～4小时后去除贴壁细胞，再从余下细胞中使用磁珠分选出T细胞。该方法能够有效提高T细胞的纯度，T细胞得率高，且操作简单。本发明专利技术还通过改变病毒感染方法，提高嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)表达率，减少操作风险。

【技术实现步骤摘要】
一种富集T细胞的方法及其在过继性T细胞治疗中的应用
本专利技术涉及过继性T细胞疗法
，具体而言，涉及一种富集T细胞的方法，以及该方法在制备T细胞以用于过继性细胞治疗中的应用。
技术介绍
肿瘤免疫疗法近年来得到广泛的关注和应用，该疗法通过激活机体的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除恶性肿瘤细胞(SanmamedMF,etal.Cell.2019,176:677)。癌细胞由正常细胞经过基因突变或表观遗传改变转化而成，其表达很多异常的肿瘤抗原。正常情况下，人体先天免疫系统可通过识别肿瘤抗原特异性识别和杀死癌细胞。然而，癌组织采用各种机制构建免疫抑制微环境，使免疫细胞如T和B淋巴细胞对癌细胞产生免疫耐受，从而恶性进展(KalathilSG,etal.CancerImmunolImmunother.2016,65(7):813)。肿瘤免疫疗法通过打破免疫耐受，重新启动并维持肿瘤-免疫循环，与传统疗法相比，具有疗效好和毒副作用小的显著优势。过继性T细胞疗法是一种新兴的肿瘤免疫疗法，利用体外富集和工程化修饰的人T细胞特异靶向和杀伤患者体内的癌细胞(YangJC,etal.AdvImmunol.2016,130:279)。目前已有的过继性T细胞疗法包括肿瘤浸润淋巴细胞、嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptor-engineeredTcell,CAR-T)、T细胞受体嵌合型T细胞(Tcellreceptor-engineeredTcell,TCR-T)等。国内外已经开发了各种技术来富集能够靶向肿瘤抗原的天然存在的T细胞，或者通过基因修饰T细胞以特异性靶向已知的肿瘤抗原。临床研究已证实过继性T细胞疗法能显著抑制癌症进展，延长患者生存时间，尤其是CAR-T技术的出现，使人类对癌症的控制得到了里程碑式的发展(JuneCH,etal.Science.2018,359:1361)。该技术在肿瘤治疗中的应用始于1989年，已在复发难治性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等恶性血液肿瘤中实现了60-95％的响应率(ParkJH,etal.NEnglJMed2018,378:449；NeelapuSS,etal.NEnglJMed2017,377:2531；CohenAD,etal.JClinInvest.2019,130:pii:126397)，并在一些恶性实体瘤如神经胶质瘤、肝癌、黑色素瘤中也显示出了潜在的治疗效果(MiglioriniD,etal.ClinCancerRes.2018,24:535；GaoH,etal.ClinCancerRes.2014,20:6418；ForsbergEMV,etal.CancerRes.2019,79:899)。目前CAR-T技术中使用的T细胞主要来源于患者自身，受患者病情的影响较大。T细胞通过三种方法分离得到：一是用磁珠直接从PBMCs中分离；二是将PBMCs通过多次贴壁的方法收集细胞，加入磁珠激活；三是将PBMCs通过多次贴壁的方法收集细胞，加入磁珠激活，激活后采用磁珠分离T细胞。前两种方法分离得到的T细胞纯度低，影响T细胞激活效率、CAR表达率及细胞增殖效率，第三种方法中激活后分选影响细胞的活性，T细胞得率降低，对可感染T细胞数目可控性低。此外，利用现有技术分离的T细胞在后续病毒感染过程中，还存在目的蛋白的表达率较低等问题。因此，T细胞的分离纯化和病毒感染方法亟待改进，这对提高过继性T细胞疗法的临床应用成功率至关重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术涉及一种富集T细胞的方法，包括将PBMCs培养1～4小时后去除贴壁细胞，再使用磁珠从余下细胞中分选出T细胞。从PBMCs中分离得到的T细胞纯度低，含有部分巨噬细胞和树突状细胞等贴壁细胞以及B细胞等，这导致T细胞激活效率低，病毒感染效率低，目的细胞组分不明确。本专利技术所提供的T细胞富集方法，能够有效提高T细胞的纯度，T细胞得率高，且操作简单。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及如上所述方法在制备T细胞免疫治疗药物中的应用；所述T细胞免疫治疗药物中包括下述细胞中的一种或多种：肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒T细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、T细胞受体嵌合型T细胞、自然杀伤T细胞和外周血淋巴细胞。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及制备CAR-T细胞的方法，其包括：i)用如上所述的方法富集T细胞；ii)在T细胞激活24～48小时后接种携带有CAR表达片段的病毒；以及iii)培养T细胞。本专利技术通过改变病毒感染方法，提高CAR表达率，减少操作风险。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中不同来源的PBMCs分离得到的T细胞增殖情况；图2为本专利技术一个实施例中PBMCs贴壁后，单核细胞去除流式图；BNK：贴壁前；1-BNK：贴壁后；图3为本专利技术一个实施例中使用不同beads与T细胞比例分选T细胞的情况；图4为本专利技术一个实施例中感染辅助因子对CAR表达率的影响；图5为本专利技术一个实施例中不同IL-2浓度对细胞增殖的影响；图6为本专利技术一个实施例中三个患者来源的CAR-T细胞的培养扩增情况。具体实施方式根据本专利技术的一方面，本专利技术涉及富集T细胞的方法，其包括将PBMCs培养1～4小时后去除贴壁细胞，再使用磁珠从余下细胞中分选出T细胞。淋巴细胞是悬浮细胞或极少贴壁，贴壁处理可去除PBMCs中的巨噬细胞等杂细胞。本专利技术仅进行一次处理贴壁培养，T细胞损失少。PBMCs指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。在本专利技术中，若无特别说明，则涉及到的细胞培养条件均在30℃～45℃和1％～10％的CO2，优选为36℃～38℃和在4％～6％的CO2。分选出的T细胞的特异亚群可选择例如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞中任意阳性组合的细胞；在一些实施方式中，分选出的T细胞为CD3+CD28+T细胞。上述亚群的T细胞可通过正或负选择技术进一步分离。例如CD3+CD28+T细胞可用CD3/CD28缀合的磁珠进行正选择(例如，DynabeadsCD3/CD28)。在一些实施方式中，用CD3/CD28抗体缀合的磁珠与所述余下细胞以磁珠：T细胞＝(1～3):1，例如1.5:1、2:1、2.5:1的比例进行孵育，再利用所述磁珠分选出T细胞。其中，(1～3):1指的是磁珠数量和T细胞数量的比值。T细胞数量和通过对所述余下细胞进行形态学观察等常规方法进行预估。在一些实施方案中，所述PBMCs培养时的接种密度为(0.5～1.5)×108cells/30mL；优选为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.富集T细胞的方法，其特征在于，包括将外周血单个核细胞(PBMCs)培养1～4小时后去除贴壁细胞，再使用磁珠从余下细胞中分选出T细胞。/n

【技术特征摘要】
1.富集T细胞的方法，其特征在于，包括将外周血单个核细胞(PBMCs)培养1～4小时后去除贴壁细胞，再使用磁珠从余下细胞中分选出T细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分选出的T细胞为CD3+CD28+T细胞；
优选的，所述磁珠为CD3/CD28抗体缀合的磁珠，其与所述余下细胞以磁珠：T细胞＝(1～3):1的比例进行孵育，再利用所述磁珠分选出T细胞；
优选的，其特征在于，所述PBMCs培养时的接种密度为(0.5～1.5)×108cells/30mL；
优选的，其特征在于，在进行所述分选时，细胞密度为(0.15～0.6)×106cells/mL；
优选的，所述PBMCs来自需要过继性T细胞疗法的受试者；
优选的，所述PBMCs来自单采血、外周血全血或外周血干细胞；
优选的，其特征在于，所述PBMCs是新鲜分离的细胞或冻存后复苏的细胞。


3.权利要求1或2所述方法在制备T细胞免疫治疗药物中的应用；
所述T细胞免疫治疗药物中包括下述细胞中的一种或多种：肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒T细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、T细胞受体嵌合型T细胞、自然杀伤T细胞和外周血淋巴细胞。


4.制备CAR-T细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁薪安，何霆，齐菲菲，
申请(专利权)人：北京艺妙神州医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11