免疫反应测定方法技术

免疫反应测定方法，该方法测定试样中含有的抗原或抗体被测物，其特征在于包含下述步骤：（Ａ）将选自具羟基的二元羧酸、具双键的二元羧酸、化学式（１）：ＨＯＯＣ（ＣＨ↓［２］）↓［ｎ］ＣＯＯＨ（ｎ为整数）所表示的直链二元羧酸以及它们的盐中的 至少一种化合物，以及可与上述被测物特异性结合的特异结合物质－－抗体或抗原和上述试样混合，得到酸性反应液的步骤；（Ｂ）在上述反应液中检测因上述被测物与上述特异结合物质结合的抗原抗体反应而产生的抗原－抗体复合物的步骤。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对试样中含有的抗原或抗体被测物进行测定的，以及其中使用的免疫反应测定试剂。
技术介绍
在医疗领域，为了进行各种疾病的诊断和调查病状过程，对存在于人体液中的各疾病的特征性蛋白质含量进行调查，这得到了广泛的应用。作为这些蛋白质含量的测定方法，利用特异性高的抗原抗体反应的得到主要的、广泛的应用，目前，已开发和应用了利用各种原理的。其中，广为人知的有散射比浊法、透射比浊法和玻片凝集法等检测抗原抗体反应生成的凝集复合物的测定方法。这些方法是抗原和抗体在溶液中以同样分散的状态进行的，因此总称为均一体系的。这些反应都生成凝集复合物，反应液产生与抗原和抗体量相关的混浊。散射比浊法、透射比浊法是光学测定该混浊的方法，散射比浊法是依据反应体系中被散射掉的光量而测定混浊，透射比浊法是依据反应体系中因散射而减少的透射光量而测定混浊。通常可以使用同一个反应液(反应体系)作为两种方法的测定对象，由其中之一的方法测定的对象，也可用剩下的另一种方法进行测定。玻片凝集法是在载波片上等通过目视等判定因凝集复合物的生成而产生的混浊的方法，可以使用与散射比浊法、透射比浊法相同的反应体系。在上述目前的均一体系中，为了促进抗原抗体反应，高灵敏度地测定微量成分，尝试使用了各种添加剂。已知的例子有使聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚氯乙烯等水溶性高分子与反应体系混合，促进抗原抗体反应产生凝集复合物，缩短反应时间和提高测定灵敏度的方法已被证实。这些水溶性高分子中，已知聚乙二醇可以以比较低的浓度获得高的效果，普遍采用以2-6重量％的浓度使用平均分子量6000的聚乙二醇的方法。特别是4重量％浓度产生的非特异性混浊少，效果高。关于水溶性高分子对抗原抗体反应的促进效果，通常其分子量越大、所使用的水溶液的浓度越高，则促进效果越大。应用于抗原抗体反应的测定时，则抗原抗体反应的程度、即与抗原浓度相关的信号强度高，可保持良好的S/N比，可进行稳定的测定。但是，当希望通过进一步促进抗原抗体反应获得上述效果时，以往的水溶性高分子的添加需要添加更高浓度或高分子量的水溶性高分子。这样一来，由于溶解水溶性高分子的溶液的粘性增大，出现了分析操作困难的问题。另外，已知在均一体系的中通常出现被称为环带现象的现象。环带现象是指抗原和抗体中任一方过量存在，其量超过形成最大凝集复合物的当量区时，凝集复合物变得难以生成的现象。关于多价抗体与2价或以上的抗原之间的结合反应，Hidelberger等人的格子假说是很有名的，例如在William E.Paul编的“Fundamental Immunology”1984年和多田富雄监译“基础免疫学”1987年，p.714-716中有详细记载。在实际的均一体系的免疫反应测定中，大多是使用抗体测定抗原浓度。另外，抗原浓度高时比低时，其测定值往往具有重要的意义。因此，因抗原过量而产生的环带现象大多会带来一些问题。在环带以外的区域，生成含有抗体与抗原交互结合形成的复合物的巨大分子链，当抗体浓度一定时，该分子链的量和大小随抗原浓度增加。通过光学变化量测定该分子链的量和大小，可以定量计算抗原浓度。另外，抗原-抗体复合物随着抗体和抗原的浓度的变化，作为溶液中的混浊和凝集物，足可以用肉眼进行确认，因此，可以通过目视等进行定性判定。但是在抗原过剩区，抗原比抗体更过量地存在，结合部位被抗原所饱和的抗体的量增加。因此，之前所述的分子链难以生成，这种情况下的反应结果难以与抗原为低浓度时的反应结果进行区别。因此不能进行与抗原浓度相关的正确的定量或判定，另外，为了避免该问题，测定浓度范围也受到了限制。有人提出了以下的方法作为改善该环带现象的方法。例如日本特开平09-08984号公报中公开了在pH6.0-8.0的中性条件下，使氯化钠浓度为20-250g/L，抑制免疫反应，不稀释被测定物地进行测定的方法；日本特开平10-332694号公报中公开了在pH3.5-5.5的酸性条件或在pH9.0-12.0的碱性条件下，使氯化钠浓度为10-250g/L，抑制免疫反应，不稀释被测定物地进行测定的方法。日本特开平11-344494号公报中提出了例如在pH7.4的中性条件下，使氯化钠浓度为0.05-0.08M，使免疫反应的一方一一抗体或抗原与不溶性载体颗粒结合，进行免疫学凝集反应，在该反应中，使选自苹果酸、戊二酸、己二酸、丁二酸和它们的盐以及酯中至少一种的二元羧酸以1-20重量％在反应体系中含有的方法。但是，上述公报中所述方法都有下述问题在环带区以外的测定区域，免疫反应的测定值低。因此本专利技术的目的在于鉴于上述问题，提供可容易地提高测定值的、以及该测定方法中使用的免疫反应测定试剂。本专利技术的目的还在于提供可以放宽由于在抗原过剩区发生的环带现象所导致的对测定范围的限定的、以及该测定方法中使用的免疫反应测定试剂。
技术实现思路
本专利技术涉及免疫反应的测定方法，该方法测定试样中含有的抗原或抗体被测物，其特征在于包含下述步骤(A)将选自具羟基的二元羧酸、具双键的二元羧酸、化学式(1)HOOC(CH2)nCOOH(n为整数)所表示的直链二元羧酸以及它们的盐中的至少一种化合物(以下称为“特定化合物”)，与上述被测物特异性结合的特异结合物质——抗体或抗原与上述试样混合，得到酸性反应液的步骤(B)在上述反应液中检测因上述被测物与上述特异结合物质通过抗原抗体反应而产生的抗原-抗体复合物的步骤。优选上述具羟基的二元羧酸是苹果酸和酒石酸，上述具双键的二元羧酸是衣康酸、富马酸和马来酸。优选上述直链二元羧酸的亚甲基链的长度为n＝1-7的整数。进一步优选在上述反应液中添加缓冲剂。优选将上述反应液的pH设定为4.0-6.0。优选将上述反应液的pH设定为4.5-6.0。还可以将上述反应液的pH设定为4.5-5.0。也可以将上述反应液的pH设定为5.0-6.0。优选上述反应液中上述特定化合物的浓度设定为0.1M或以下。上述反应液中上述特定化合物的浓度还可以设定为0.01-0.1M的范围。上述反应液中上述特定化合物的浓度也可以设定为0.01-0.05M的范围。优选上述反应液含有2-6重量％的聚乙二醇。优选上述抗原-抗体复合物为凝集复合物。上述步骤(B)中，优选通过测定因上述凝集复合物导致的光学变化量来检测上述凝集复合物。优选上述光学变化量是散射光强度的变化量。优选上述特异结合物质是含有单克隆抗体的抗体。还优选上述特异结合物质是制备成一种或以上的单克隆抗体的混合物，以便于生成凝集复合物。优选上述抗原是人白蛋白。本专利技术还涉及免疫反应测定试剂，该免疫反应测定试剂是在测定上述试样中含有的抗原或抗体被测物的中使用的，其特征在于含有选自具羟基的二元羧酸、具双键的二元羧酸、化学式(1)HOOC(CH2)nCOOH(n为整数)所表示的直链二元羧酸以及它们的盐中的至少一种化合物(特定化合物)，与上述被测物特异性结合的特异结合物质——抗体或抗原；制备上述被测物与上述特异结合物质发生抗原抗体反应时反应液的pH为酸性的试剂。此时也优选上述具羟基的二元羧酸是苹果酸和酒石酸，上述具双键的二元羧酸是衣康酸、富马酸和马来酸。优选上述直链二元羧酸的亚甲基链的长度为n＝1-7的整数。进一步优选上述免疫反应测定试剂含有缓冲剂。优选上述免本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：龟井明仁，河村达朗，汤川系子，
申请(专利权)人：松下电器产业株式会社，
类型：发明
国别省市：