重金属Pb2+完全抗原的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重金属Ｐｂ↑［２＋］完全抗原的制备方法。该方法如下：取３．０～１０．０ｍｇ重量份载体蛋白、０．４～１．８ｍｇ重量份双功能鳌合剂、０．３～０．８ｍｇ重量份Ｐｂ（ＮＯ↓［３］）↓［２］及１．４～４．５ｍｇ重量份三乙胺，于１．０～３．０ｍｌ体积份的ＨＥＰＥＳ缓冲溶液中溶解，１５～３０℃温度下振荡８～２４小时后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于ＨＥＰＥＳ缓冲溶液中保存，分装，得成品。本发明专利技术所得抗原具有较好的免疫原性，用此抗原免疫小鼠能制备Ｐｂ特异性抗体，可以进一步制备重金属Ｐｂ快速检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学检测方法检测重金属Pb2+残留的抗原的制备方法。
技术介绍
现已知至少20种左右的重金属有很大的毒性，它们中又有一半以上被大量排放的周围环境中。重金属属于永久性污染物质，它们的半衰期一般都在几十年以上，并且不能通过化学或生物修复等方法进行有效去除。我国目前沿用的传统重金属检测方法需要大型、昂贵的检测仪器，虽然能精确检测样品中单种金属的总量，但存在着费力、费时、费用昂贵、需要进行大量的样品预处理，并且样品的检测需在设有大型分析设备的室内进行，不能用于现场检测等缺点。此外，这些检测方法不能提供重金属的氧化状态或者演变信息。近年来由于我国社会经济的高速发展，重金属等污染物质被大量排放到周围环境中，由于重金属属于永久性污染物，并能被初等植物富集，通过食物链传递而进行生物放大作用，对人类健康造成严重威胁，因而需要对环境中的重金属残留尤其是市售食品重金属残留进行长期监测。免疫学检测方法是一种新型、高效快速的检测方法，该方法具有检测速度快、费用低廉、简单易携、具有高度的灵敏度和选择性的特点，理论上能应用于能产生合适抗体的任何污染物质，目前被广泛应用于临床医学、动物检疫、食品科学、植物病毒、药物残留、病虫害防治等分析领域。建立重金属免疫学检测方法的关键点在于重金属完全抗原的制备，重金属离子由于其分子量较小，并且具有毒性，不能直接作为免疫原免疫动物，因而需要运用特殊的方法制备重金属完全抗原。国外自从Reardan等人首次通过金属-鳌合剂抗原制备出单克隆抗体以来，越来越多的抗Hg2+、In3+、Cd2+、Pb2+、U6+等金属-鳌合剂复合物的单克隆抗体被制备出来，建立了KinExA法、间接竞争ELISA法、一步竞争性免疫检测法、荧光偏振免疫检测法等重金属免疫检测方法，检测限能达到ppb级别，并进行了抗原-抗体的结合属性的相关研究，这些研究基本上还处于实验室研究阶段。此外，国外水体受Cd2+离子污染最为严重，因而针对对Cd2+离子进行的相关研究最多，并取得了一定的进展Blake等人正在研制Cd2+离子免疫传感器模型，检测结果能达到与ICP-AES可比的检测水平，并且他们正在与公司合作开发重金属免疫传感器。而国内尚未见到相关报道。重金属免疫学检测方法的建立为重金属污染物的检测提供了另一途径。重金属免疫学检测方法建立的关键在于金属完全抗原的制备。重金属离子自身不能作为有效的抗体识别目标，因为它们带有电荷，趋向于与生物分子发生强烈的不可逆的反应(这也是重金属的毒性所在)，选用鳌合剂与金属离子配位使之与生物分子的反应能力减弱，这种金属—鳌合剂复合物应能够提供一个能被动物免疫系统识别的有机物外壳。但这种重金属—鳌合剂复合物是低分子的半抗原，不足于引起小鼠的免疫反应的发生，因此选用结构较复杂的大分子双功能鳌合剂，一方面鳌合重金属，另一方面通过其上的硫氰基团将其偶联到载体蛋白(BSA或KLH)上，从而制备出完全抗原。国外运用此理论目前已经建立了Hg2+、In3+、Cd2+、Pb2+、U6+等重金属酶联免疫快速高效检测方法，检测限能达到ppb级别，其检测结果甚至能达到与ICP-AES可比的程度，但这些研究成果目前还处于实验室研究阶段，离实际应用还有一段距离。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重金属Pb2+完全抗原的制备方法，为制备重金属Pb2+残留快速检测试剂盒或者传感器提供物质基础。为达上述目的，本专利技术的重金属Pb2+完全抗原的制备方法如下取3.0～10.0mg重量份载体蛋白、0.4～1.8mg重量份双功能鳌合剂、0.3～0.8mg重量份Pb(NO3)2及1.4～4.5mg重量份三乙胺，于1.0～3.0ml体积份的HEPES缓冲溶液中溶解，15～30℃温度下振荡8～24小时后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于HEPES缓冲溶液中保存，分装，得成品。所述双功能鳌合剂为常用重金属鳌合剂二乙烯三胺五乙酸(以下称DTPA)或者乙二胺四乙酸(以下称EDTA)的硫氰基衍生物，例如CHX-A”-DTPA(N--trans-cyclohexane-1，2-diamine-N，N’，N’，N”，N”-diethylenetriamine pentaacetic acid)、1B4M-DTPA(p-SCN-C6H5-DTPA)、1B4M-EDTA(p-SCN-C6H5-EDTA)等。所述载体蛋白、双功能鳌合剂、Pb(NO3)2及三乙胺的优选重量比为(4～8)∶(0.7～1.2)∶(0.4～0.7)∶(2.5～4.0)。所述载体蛋白、双功能鳌合剂、Pb(NO3)2及三乙胺的最佳重量比为5∶0.9∶0.6∶3。所述的Pb(NO3)2的纯度级别为光谱纯度级别。所述载体蛋白可以为钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白或卵白蛋白等。所述用于溶解反应物的HEPES缓冲溶液的浓度为30～100mM，PH为8.5～9.5。用于保存生成物的HEPES缓冲溶液的浓度为30～60mM，PH为7.0～7.4。当采用超滤方法去除未反应的低分子物质时，选用截留分子量为10000～30000dal的超滤离心管，3000～6000rpm超滤三次，每次4～8分钟。当采用透析方法去除未反应的低分子物质时，将待透析物置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析3天。对采用本专利技术的方法制得的完全抗原进行了以下几方面的检测1、完全抗原中载体蛋白质氨基酸替代度检测利用A.F.S.A.HABEEB于1966年提出的运用TNBS(详见Analytical Biochemistry，1966，14，328～336)来检测蛋白质中自由氨基酸基团数量法来检测蛋白质在偶联前后自由氨基酸基团数量的变化，从而计算出其蛋白质氨基酸替代度。运用此法计算出上述制备的抗原中蛋白质氨基酸替代度为23.8～53.6％，此结果表明双功能鳌合剂与载体蛋白质偶联成功。2、完全抗原中Pb离子含量测量为了进一步确定Pb离子是否与双功能鳌合剂鳌合，接着用ICP-AES法对制备抗原中的Pb离子含量进行检测，其结果为36.48～54.02mg/L，此结果表明抗原中Pb离子与双功能鳌合剂鳌合成功。3、完全抗原免疫原性检测通过步骤1和2制备出的完全抗原，需要检测其是否具有免疫原性。取此抗原与等量佐剂用注射器双推法混合均匀，常规免疫小鼠，免疫4～5次后测小鼠血清效价，对血清效价较高的小鼠，取其脾脏进行细胞融合，经过后续一系列步骤制备出小鼠腹水性Pb特异性单抗，对其也进行了效价检测。用含Pb完全抗原与无Pb完全抗原(二者的载体蛋白与免疫小鼠所用抗原的载体蛋白不同)包被酶标板，用间接ELISA法检测血清、腹水的效价以及它们对Pb离子特异性，结果显示二者效价分别为1/(4.1×105～8.2×105)和1/(2.0×105～4.1×105)，并且在对二者进行检测时，用含Pb完全抗原作为间接ELISA检测抗原时的OD值远大于无Pb完全抗原，说明原抗原具有较好的免疫原性，用此抗原免疫小鼠能制备Pb特异性抗体，可以进一步制备重金属Pb快速检测试剂盒。本专利技术成功解决了重金属Pb2+完全抗原制备难题，在我国实属首创。应用本项专利免疫动物制备金属特异性单抗，进而研制重金属快速高效检测试剂盒、试剂条或者传感器，其将成为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重金属Ｐｂ↑［２＋］完全抗原的制备方法，其特征在于：取３．０～１０．０ｍｇ重量份载体蛋白、０．４～１．８ｍｇ重量份双功能鳌合剂、０．３～０．８ｍｇ重量份Ｐｂ（ＮＯ↓［３］）↓［２］及１．４～４．５ｍｇ重量份三乙胺，于１～３ｍｌ体积份的ＨＥＰＥＳ缓冲溶液中溶解，１５～３０℃温度下振荡８～２４小时后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于ＨＥＰＥＳ缓冲溶液中保存，分装，得成品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江天久，牛涛，向军俭，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]