免疫反应测定方法及其所使用的免疫反应测定试剂技术

本发明专利技术提供了一种免疫学测定一种包含在样本中的对象物质的方法，其步骤包括在三羧酸或三羧酸盐存在下和酸性条件下使对象物质和能特异性结合到对象物质的特异性结合物质形成一种抗原抗体复合物。本发明专利技术还提供了在此方法中使用的包含三羧酸或三羧酸盐的试剂。试剂中包含有一种对象物质以及能免疫学和特异性地与对象物质结合的特异性结合物质。制备此试剂以使得对象物质和特异性结合物质能在酸性条件下结合在一起以形成抗原和抗体复合物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及能够检测样本中所含的抗原或抗体(对象物质(subject substances))的免疫反应测定方法，以及此方法中所使用的一种免疫反应测定试剂。
技术介绍
为明确各种疾病的诊断和判断疾病的进展情况，可以测定存在于人体体液内的、具有疾病特征性的蛋白的水平。此技术已在医学领域得到广泛的应用。使用高度特异性的抗原抗体反应的免疫反应测定方法主要用于此种蛋白的含量的测定。目前，多种原理已被应用于对免疫反应测定方法的改进和开发。其中，检测抗原抗体反应所形成的凝集复合物的测定方法，例如悬度测定法、浊度测定法、玻片凝集法及类似方法已广为熟知的。这些方法在溶液中进行，其中抗原和抗体是均匀分散的，因此总称为均质免疫反应测定方法。在这些方法中，反应体系因凝集复合物的产生而变得混浊，其混浊度依赖于抗原和抗体的量。悬度测定法和浊度测定法是通过光学测定混浊度的方法。在悬度测定法中，混浊度是通过测量被反应体系散射的光量而测定的。在浊度测定法中，对混浊度的测定则是基于测量由于反应体系的散射而发生的光透射衰减。总体而言，两种方法使用和测定相同的反应体系。能被一种方法测定的对象也可被另一种方法测定。玻片凝集是使用肉眼观察或类似方式对凝集复合物产生所引起的混浊度进行测定的一种方法。玻片凝集可以使用与悬度测定法和浊度测定法相同的反应体系。各种添加剂被尝试用于上述传统的免疫反应测定方法中，以便能加速抗原抗体反应并高度敏感地检测到微量的成分。例如，在反应体系中加入一种水溶性的聚合物，如聚乙二醇、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、氯乙烯、或类似物，以加速抗原抗体反应的凝集复合物形成，通过这种方法以改进反应时间和测定的敏感性。这些水溶性聚合物中，已知聚乙二醇即使是在相对低的浓度下也有很好的效果。重量百分比为2-6％(以下简写为wt％)的、平均分子量在6,000的聚乙二醇用途广泛。特别是当浓度为4wt％时，其只产生极少量的非特异性混浊度，十分高效。水溶性聚合物的分子量或浓度增加时，其促进抗原抗体反应的作用也会提高(见于《自动化免疫分析》第一部分，Ritchie编写，67-112页(1978))。对于抗原抗体反应的测定，依赖于抗原浓度的信号性抗原抗体反应的强度越大，S/N比越令人满意，即测定越稳定。然而，若想通过使抗原抗体反应进一步加速以达到上述效果，那么就需要提高所加入的传统的水溶性聚合物的分子量或浓度。但这样会增加含有此水溶性聚合物的溶液的粘度，使得分析的操作过程难于把握。在均质免疫反应测定方法中，区带现象(zone phenomenon)十分常见。区带现象指的是，当抗原抗体之一的量超出与其形成最大凝集复合物相当的重量范围时，会妨碍凝集复合物的产生。著名的Heidelberger的格子假说(lattice hypothesis)解释了多价抗体与大于一价的抗原的结合反应，其详细描述见于William E Paul所编辑的《免疫学概要》(1984)(日文版，Kiso Menekigaku，Tomio Tada负责，714-716页(1987))。在实际的均质免疫反应测定中，通常是用抗体检测抗原的浓度，较高的测定值(即抗原的浓度)比较低的测定值通常更有意义。因此，由抗原过量所引起的区带现象是常见的问题。在区带以外的区域则形成含有由抗原抗体交互连接而成的复合物的巨大分子链。如果抗体浓度不变，分子链的数量和大小随抗原的浓度增加而增大。因此，通过检测其光学变化可测定分子链的数量和大小，进而可定量测定抗原的浓度。此外，抗原抗体复合物在溶液中形成的混浊或凝集甚至可以通过肉眼进行观察，这取决于抗原抗体的浓度。因此，抗原的浓度也可通过肉眼观测而进行定性测定。但是，在抗原过量的区域，由于抗原量远大于抗体量，结合位点被抗原饱和的抗体数量增加。因此，上述分子链的形成受到影响，反应结果将无法分辨抗原浓度是低还是更高。因此将无法对抗原的浓度进行正确的定量测定。为此，必须对所检测的浓度范围做出限定以避免上述情况。本专利技术的目的之一是通过提供一种能够简便地提高测定值的免疫反应测定方法，以及一种供此方法使用的免疫反应测定试剂，以解决上述常见的问题。本专利技术的另一个目的是提供一种能够解决抗原过量的区带现象的免疫反应测定方法，以及一种供本方法使用的免疫反应测定试剂。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术用于测定样品中的抗原或抗体(对象物质)的免疫学测定方法的特征包含步骤A将三羧酸或三羧酸盐和能够特异性结合对象物质的抗体或抗原(特异性结合物质)加入至样品中，和步骤B在步骤A生成的反应体系中检测由对象物质和特异性结合物质之间的抗原抗体反应所生成的抗原抗体复合物，所述反应体系包含样品、特异性结合物质和三羧酸或三羧酸盐，并且抗原抗体发生反应时此反应体系的pH值是酸性的。此外，本专利技术的免疫反应测定试剂的特征包含三羧酸或三羧酸盐和能够特异性结合对象物质的抗体或抗原(特异性结合物质)，且所制备的试剂能够使得对象物质和特异性结合物质之间发生抗原抗体反应时的pH值是酸性的。附图简述附图说明图1所示为使用本专利技术实施例或对比例的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人白蛋白进行免疫悬液测定的测定结果。图2所示为使用本专利技术另一个实施例的含有柠檬酸的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人白蛋白进行免疫悬液测定的pH值相关性的检测结果。图3所示为使用本专利技术实施例的含有反乌头酸的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人白蛋白进行免疫悬液测定的pH值相关性的检测结果。图4所示为仍然使用本专利技术另一个实施例的含有柠檬酸的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人白蛋白进行免疫悬液测定的柠檬酸浓度相关性的检测结果。图5所示为使用本专利技术实施例的含有反乌头酸的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人白蛋白进行免疫悬液测定的反乌头酸浓度相关性的检测结果。图6所示为使用本专利技术实施例或对比例的含有三羧酸或三羧酸盐以及另一种缓冲液的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人白蛋白进行免疫悬液测定的测定结果。图7所示为使用本专利技术另一个实施例或对比例的含有山羊抗人CRP多克隆抗体以及柠檬酸的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人CRP进行免疫悬液测定的测定结果。图8所示为使用本专利技术另一个实施例或对比例的含有小鼠抗人CRP多克隆抗体以及柠檬酸的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人CRP进行免疫悬液测定的测定结果。图9所示为使用本专利技术实施例或对比例的含有小鼠抗人CRP多克隆抗体以及反乌头酸的免疫反应测定试剂、通过免疫反应测定方法对人CRP进行免疫悬液测定的测定结果。实施本专利技术的最佳方式本专利技术涉及一种能够简便地提高测定值的免疫反应测定方法，以及一种供本方法使用的免疫反应测定试剂。本专利技术还涉及一种能够解决抗原过量的区带现象的免疫反应测定方法，以及一种供本方法使用的免疫反应测定试剂。本专利技术人发现，在抗原抗体反应体系中加入三羧酸或三羧酸盐以维持反应体系的pH值为酸性，可以改善由抗原抗体结合而引起的免疫反应的测定值，并可以解决在抗原过量产生的区带现象。本专利技术的实施方案的免疫反应测定方法是一种测定样品中的抗原或抗体(对象物质)的方法，其特征包含步骤A将三羧酸或三羧酸盐和能够特异性结合对象物质的抗体或抗原(特异性结合物质)加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定以包含在样品中的抗原或抗体为对象物质的免疫反应测定方法，包括：步骤Ａ：在样品中加入三羧酸或三羧酸盐和一种作为特异性结合物质的能够特异性地结合对象物质的抗体或抗原；以及步骤Ｂ：在由步骤Ａ构成的一种反应体系中检测由对象物质和特异性结合物质之间的抗原抗体反应所生成的抗原抗体复合物，所述反应体系包含样品、特异性结合物质和三羧酸或三羧酸盐，其中的反应体系的ｐＨ值当抗原抗体反应进行时是酸性的。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：龟井明仁，权丈纪子，河村达朗，平井真人，
申请(专利权)人：松下电器产业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]