新抗体,含有该抗体的肾素-活性物质和使用该抗体的前肾素检测试剂制造技术

本发明专利技术提供了一种能特异性地识别至少含有人前肾素前片段的从第一个亮氨酸残基到第十五个精氨酸残基的１５个氨基酸残基的肽的人前肾素前片段Ｎ－末端肽抗体以及其与人前肾素的复合物。该抗体可用作前肾素检测试剂。该人前肾素前片段Ｎ－末端肽抗体可用作血液中人前肾素的检测试剂。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,含有该抗体的肾素－活性物质和使用该抗体的前肾素检测试剂的制作方法
本专利技术涉及一种新的能和人前肾素结合形成免疫复合物的人前肾素的前片段(下文称为“pf”)的N-末端肽抗体；一种在该抗体和人前肾素结合时所形成的肾素-活性物质以及一种使用该抗体的前肾素检测试剂。前肾素是一种没有酶活性的物质，其主要在肾脏中作为完全成熟型的肾素的前体或者作为结合有一个由43个氨基酸残基构成的前片段的完全成熟型肾素而产生。已知当糖尿病引起并发血管疾病时，血液中人前肾素的浓度随着该疾病的严重性而升高，且随着该疾病的好转而降低。因而提议把血液中人前肾素浓度作为糖尿病性血管疾病的标志物(见于“新英格兰医学杂志”(The New England Journal of Medicine)，第312册，1985，第1412-1417页，“东京女子医学院论文集”(Memoirs of Tokyo Women’s Medical College)，第60册，1990，第342-350页，以及“临床研究”(Clinical Investigator)，第71册，1993，第3-6页)。与此相关，迄今已有几种方案用以测量人血浆中的前肾素浓度。这些现有技术方法的问题是由于人血浆既含有作为酶蛋白的完全成熟型肾素也含有作为完全成熟型肾素前体的无酶活性人前肾素，所以必需采用一种间接方法，即其中的血浆中人前肾素首先用一种酸在低温下部分活化，然后，再用胰蛋白酶将其转变成完全成熟型肾素，再用酶学方法(测肾素活性总量)或免疫学方法(测活性肾素总量)测定肾素总量，而人前肾素量则计为从上述所得的总肾素活性或活性肾素总量中减去分别用酶学方法所得的肾素活性值或通过免疫学方法所得的活性肾素量的差值。“完全成熟型肾素”在本文中是指通过酶加工分离去其前片段部分而从前肾素衍生的结构体，并且由于酶活性部分的开放，其表现出肾素活性。上述的肾素活性是作为完全成熟型肾素固有功能的酶活性，该完全成熟型肾素是一种酶蛋白，或者，即通过选择性地作用于该肾素底物(血管紧张肽原)而产生出血管紧张肽(血管紧张肽I，Ang I)的活性。最近发现通过利用其结合于低分子肾素抑制剂的效应可将非活性的人前肾素转变成开放型结构，并且作为该发现的结果，有可能建立一种免疫学方法通过利用能特异性地识别该肾素活性部分的临近区的一种单克隆抗体以及一种能识别人前肾素和完全成熟型肾素的单克隆抗体以测定总肾素活性以及研究出一种无需加入肾素抑制剂而测定活性肾素量以从总活性肾素和上述所测的活性肾素的差值中计算人肾素量的方法(见于“临床化学”(ClinicalChemistry)，第42卷，1996，第1051-1063页)。相比于现有技术的测定肾素活性的胰蛋白酶活化的酶学方法或者胰蛋白酶活化方法，此方法虽然在可能抑制由于胰蛋白酶的人前肾素和完全成熟型肾素的瞬时降解方面以及和胰蛋白酶活化法的良好相关性方面有优势，但有一个缺点是这里所得的肾素活性和糖尿病例(其血液中前肾素滴度升高)的真实肾素活性相比有一个正偏差。此外，已知一种免疫学测定方法，其是通过利用能识别作为抗原的人前肾素的pfC末端，或者即第29-43位氨基酸残基的单克隆抗体以及能识别该单克隆抗体和完全成熟型肾素的肾素单克隆抗体的直接方法(见于“临床内分泌和代谢杂志”(Journal of Clinical Endocrinology and Matabolism)，第75卷，1992，第617-623页)。由于此法除了和胰蛋白酶活化法有极佳的相关性外，其灵敏度甚至高到了能用于测定取自健康人的血液中的前肾素滴度，所以此法是有优势的。另一方面，此法的缺点是通过本测定所得的值相比于胰蛋白酶活化法的有一个低到约80％的负偏差的趋势，这种趋势对那些表现出升高的人前肾素滴度的病人尤其明显，以及识别肾素单克隆抗体的部分的不确定性。本专利技术的主要目的因而是通过克服胰蛋白酶活化法的缺点而提供一种通过利用一种肾素抑制剂测定活化的总肾素活性而测定人前肾素的间接法以及一种利用能识别在现有技术中作为抗原的人前肾素的pf的C末端的抗体的直接免疫法，一种能精确地和方便地测定糖尿病性血管疾病发生的检测前肾素的试剂。因此，本专利技术提供了一个能特异地识别作为抗原的包括人前肾素前片段的N末端肽的从第一位的Leu残基到第十五位的Arg残基的氨基酸残基的肽的人前肾素前片段的N-末端肽抗体。此外，本专利技术提供一种新的肾素-活性物质，其是人前肾素和上述人前肾素前片段的N末端肽的复合物。此人前肾素前片段的N末端肽抗体可用于作前肾素检测试剂的有效成份。附图的简述附图说明图1是表示当人前肾素和pf的N末端肽抗体IgG反应时，该IgG浓度和人前肾素量间的关系的图。图2是表示在人前肾素和pf的N末端肽抗体反应时，pf的N-末端肽抗体的抑制活性的图。图3是表示前肾素和pf的N末端肽抗体的复合物的激活能力的剂量依赖性的图。图4是表示pf的N末端肽抗体的前肾素结合能力和凝胶过滤层析中的洗脱组分间的关系的图。图5是表示前肾素分子量和pf的N末端肽抗体间的对比检测的图。图6是表示胰蛋白酶活化方法和使用本专利技术的检测试剂的方法的相关性的图。图7是表示该前肾素浓度和Ang I产生量间的相关性的图。图8是表示本专利技术的检测试剂的酶活性对三种人前肾素的浓度函数的图。本专利技术人事先研制了一种通过利用能特异性地识别由43个氨基酸残基组成的人前肾素的pf部分的抗体的检测人前肾素的试剂(见于日本专利公开8-285852)。作为进一步研究的结果，他们成功地得到能特异性地识别作为抗原的人前肾素的pf N末端的1-15位氨基酸残基组成的肽的高度亲和性抗体，并且还发现了在该pf N末端抗体结合于人前肾素时形成肾素活性物质，从而可能通过应用该测定AngI竞争性酶的免疫学方法(见于“临床和实验性高血压-理论和实践”(Clinical and Experimental Hypertension-Theory andPractice)，A12卷，1990，第83-95页)精确地测定血液中前肾素滴度并进而完成基于该发现的上述本专利技术。可用诸如下列方法制备按照本专利技术的人前肾素的pfN末端肽抗体。首先，通过固相肽合成法合成了对应于人前肾素pfN-末端肽的由Leu-Pro-Thr-Asp-Thr-Thr-Thr-Phe-Lys-Arg-Ile-Phe-Leu-Lys-Arg氨基酸残基组成的肽并从而通过使用诸如顺丁烯二酰亚胺化合物的交联剂将该合成肽与一种诸如牛血清白蛋白，卵白蛋白和匙孔血蓝蛋白(keyhole lympet hemocyanin)的载体结合以给出一种免疫抗原。其次，将每种该免疫抗原和弗氏完全佐剂充分混和，并通过给药而免疫体重大约2.5公斤的成年兔。每两周重复此免疫处理一次，并在第五次处理后，从耳缘静脉取少量血以用于抗体滴度检测。当该抗体滴度充分升高时，对兔采全血并从中获得抗血清。这样得到的抗血清上二乙氨乙基-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose)层析以给出pfN-末端肽抗体IgG。为了代替通过用免疫抗原免疫兔所得的多克隆抗体，另一个替代的方法是可以通过用该免疫抗原按迄今已知的方法免疫小鼠而制备单抗。通过假定该IgG的分子量为150,000而从在280纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能特异性地识别至少含有人前肾素前片段的Ｎ－末端肽的第一位亮氨酸残基到第十五位精氨酸残基的１５个氨基酸残基的肽的人前肾素前片段的Ｎ－末端肽抗体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：村上和雄，中村征夫，铃木文昭，石田雄一，羽田野泰彦，
申请(专利权)人：常盘化学工业株式会社，石田雄一，
类型：发明
国别省市：JP[日本]