一种ＨＩＶ－１ɡｐ１６０膜蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种糖基化修饰的ＨＩＶ－１ｇｐ１６０膜蛋白，还涉及一种利用生物反应器连续灌注培养所述膜蛋白的制备方法，及其作为抗原制剂的应用。所述膜蛋白无致病危险，有糖基化修饰和正确空间结构，能在生物反应器内大规模制备。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及真核系统蛋白质的表达，制备及其在诊断试剂领域中的应用，尤其是涉及一种经糖基化修饰的HIV-1 gp160膜蛋白，还涉及一种利用生物反应器连续灌注培养所述膜蛋白的制备方法，及其作为抗原制剂的应用。
技术介绍
已知人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种导致免疫缺陷综合症的病原体，其感染人体后会引起人体的免疫反应，产生对应的抗体。通过检测血液或体液中是否存在HIV抗体，可判断该标本是否感染了HIV。HIV包膜是体液免疫应答的主要靶位，产生的对应抗体统称为抗env区抗体，包括抗gp160抗体、抗gp120抗体和抗gp41抗体。世界卫生组织、美国食品和药品管理局、中国卫生部等制定的蛋白免疫印迹法HIV感染判断标准中，均规定必须有抗env区抗体反应条带(李敬云，艾滋病的病原学诊断，北京军事医学科学出版社，1999，29-35)。大量研究报道也证实HIV感染者血样中均含有抗env区抗体。据此，检测HIV抗体在很大程度上是检测抗env区抗体。现有的免疫学诊断技术一般利用抗原-抗体反应来检测抗env区抗体。可与抗env区抗体结合的抗原有gp160、gp120、gp41，获取手段有血液提取、大肠杆菌系统基因工程表达、化学方法多肽合成等。从片段选择上看，gp41是目前应用最多的片段，其检测的是抗gp41抗体。但根据世界卫生组织、美国食品和药品管理局、中国卫生部等制定的蛋白免疫印迹法HIV感染判断标准，如果po1区有一条反应线，则抗gp41、抗gp120、抗gp160中只要出现一条反应线就判定为HIV感染，也就是说完全可能存在抗gp41阴性，而抗gp160或抗gp120阳性的HIV感染标本。因此在HIV抗体检测中仅依靠gp41是不够的。而gp160作为gp120和gp41的前体，包含了env区大多数的抗原决定簇，是env区各种抗原中最适合诊断试剂使用的。从获取方法上看，其中从HIV感染者血液中或从HIV感染后的淋巴细胞裂解液中分离获取的HIV抗原，由于对HIV灭活工艺能否始终保持100％有效性的担忧，无论对抗原的制备者，还是对抗原的使用者来说，都存在现实的或潜在的致病危险性。这严重限制了该技术的使用。在EP-A-O 326 490中描述了用化学合成的方法制备HIV-1 gp41，US 5,800,983中描述了化学合成的方法制备HIV-1 gp160片段，上述合成肽均可用于检测HIV-1抗体。由于化学合成多肽的技术已经较为成熟，所以该方法可实现大规模的、良好重复性的生产。但用化学方法合成多肽，受反应效率和得率的限制，片段长度只能有数十个氨基酸残基，无法包括更多的抗原决定簇。同时现有的工业化合成技术获得的是线性肽或分支肽，缺少二级结构，也无法实现必要的转录后修饰，免疫学活性受到很大限制，应用于诊断试剂时存在对阳性标本漏检的可能。US 5,834,267和韩保光等(细胞与分子免疫学杂志，1999年，第15卷，第2期)分别描述了一种以大肠杆菌BL21或DH5α为宿主菌制备基因工程gag-env融合抗原的技术。大肠杆菌系统具有很高的表达效率，获得的各类HIV抗原成本低、安全性好，但同天然抗原相比缺少转录后糖基化修饰，且通过包涵体方式获得的抗原的空间结构，特别是二硫键位置与天然抗原有显著差异，造成抗原活性下降和非特异性上升。此外，现有的表达载体系统均针对表达分子量数万道尔顿的蛋白质设计，当用于表达分子量超过十万道尔顿的蛋白质，如gp160时，存在表达量低、质粒不稳定的可能。真核表达系统是获取经糖基化修饰的抗原的主要途径。目前较多使用非人源细胞系统。如Wells DE用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内表达gp160(Wells DE，Compans RW，Virology 1990 Jun；176(2)575-86)，Fenouillet E用CHO细胞表达env抗原(Fenouillet E，et.al，Virology 1997 Apr 28；231(1)89-95)。但上述非人源细胞在糖基化机制上同人细胞不同，用上述非人源细胞真核表达系统获得的gp160抗原与天然抗原在糖基化结构和水平上有一定差异。用人源细胞表达gp160抗原无疑是最为理想的。US 5,580,720描述了一种用BJAB细胞系真核细胞表达gp160的技术。US 6,074,646描述了一种用CEM细胞系真核表达gp160的技术。前者所用的是一种CD4-、EB病毒阴性的、人Burkitt′s淋巴细胞系，属于人B-淋巴细胞系。但在天然状况下，HIV进入人体后会首先集中攻击CD4 T淋巴细胞，平均每天有2亿个CD4 T淋巴细胞被杀死，同时释放出约10亿个HIV病毒(Ho DD，et al.Nature，1996，373123-126)。因此，T淋巴细胞作为HIV病毒天然状况下的主要宿主细胞，更适合于制备gp160。后者将HIV gp160基因片段装入真核细胞表达载体，再转导入分离自急性淋巴细胞白血病患者外周血的人T-淋巴细胞系，获得的基因工程抗原只是HIV gp160基因片段的一部分，并不能包括全部的抗原决定簇。总结上述专利技术与研究成果，均存在不同方面的局限性。因此，本专利技术提供一种无致病危险、有糖基化修饰和正确空间结构、包含大量抗原决定簇的抗原的制备方法及以其为原料，制备用于HIV抗体诊断的抗原标记物，克服了上述缺陷。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题之一是提供一种HIV-1 gp160膜蛋白，它能特异地免疫结合HIV-1抗体，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示，是HIV-1 env区编码的HIV膜蛋白gp160或gp160的一部分，并带有高甘露糖型或杂合型的N-糖基化修饰，经SDS-PAGE测定的分子量为130,000-140,000道尔顿。克服了现有技术中有致病危险性，只含部分抗原决定簇，或免疫活性受抑制等缺陷。本专利技术需要解决的技术问题之二是提供一种在生物反应器内连续灌注培养以制备HIV-1 gp160膜蛋白的方法，克服了现有技术中未用生物反应器进行大规模制备的缺陷。本专利技术需要解决的技术问题之三是提供HIV-1 gp160膜蛋白作为抗原制剂的应用。在天然状态下，HIV攻击靶细胞后，在靶细胞内首先合成gp160膜蛋白，然后在胞内经酶切后形成gp41和gp120，因此gp160膜蛋白作为gp41和gp120膜蛋白的前体，基本包括了gp41和gp120上的各主要抗原决定簇。本专利技术的方法即针对gp160膜蛋白。在天然状况下，HIV病毒以人T淋巴细胞为主要宿主细胞，在宿主细胞内完成包括gp160在内的各种病毒蛋白的合成与修饰，随后宿主细胞裂解，包括gp160在内的病毒蛋白及组装完毕的病毒颗粒一起被释放。据此可以认为用HIV病毒感染人T淋巴细胞后得到的gp160膜蛋白是处于或接近天然空间结构的。作为一种真核表达系统，它可以对gp160膜蛋白进行充分的包括糖基化在内的转录后修饰。本专利技术用真核细胞作为合成gp160的宿主，并认为人T淋巴细胞系HUT-78为最优化结果，同时建立获得分泌gp160，但又不发生细胞裂解、不释放具感染力的HIV颗粒的特定细胞株的方法。由于HIV的聚合酶没有阅读校正功能，致使复制后得到的HIV病毒基因组突变几率较高。目前已知HIV本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＨＩＶ－１ｇｐ１６０膜蛋白，其特征在于，它能特异地免疫结合抗ＨＩＶ－１ｅｎｖ抗体，其氨基酸残基序列如ＳＥＱＩＤＮＯ．：１所示，是ＨＩＶ－１ｅｎｖ区编码的ＨＩＶ膜蛋白ｇｐ１６０或ｇｐ１６０的一部分，并带有高甘露糖型或杂合型的Ｎ－糖基化修饰，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定的分子量为１３０，０００－１４０，０００道尔顿。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王缦，陈晓波，黄建旬，翁辰川，
申请(专利权)人：上海科华生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]