本发明专利技术公开了一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置和方法。该装置包含光源、准直镜、比色皿、比色皿支架、积分球和光纤光谱仪；沿着光轴方向，光源、准直镜、比色皿支架、积分球的入射孔依次排布，其中，准直镜、比色皿支架和积分球的入射孔为紧贴着连接；比色皿设置于比色皿支架上，比色皿宽度不小于积分球的入射孔的直径；积分球通过光纤与光纤光谱仪连接。本发明专利技术通过将待检测悬液样品放置于设置于比色皿支架上的比色皿中；光束由光源发出，经准直镜到达比色皿支架，经过待检测悬液样品后发生散射，由积分球捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白检测领域，特别涉及一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置和方法。
技术介绍
土壤微生物是驱动元素生物地球化学循环的引擎，其驱动的氧化还原过程是联系不同圈层物质与能量交换的重要纽带。1987年，美国科学家Derek Lovely首次从沉积物中分离获取了一株能够利用胞外固态物质为电子受体的微生物—金属还原地杆菌GS-15(Geobacter metallireducens GS-15)。1988年，美国科学家Ken Nealson从纽约Oneida湖的沉积物中分离获取了另一株具有相同能力的微生物—希瓦氏奥奈达MR-1(Shewanella oneidensis MR-1)。这两株微生物的发现，开启了胞外呼吸的新领域。胞外呼吸是指厌氧条件下，微生物在胞内彻底氧化有机物释放电子，产生的电子经胞内呼吸链传递到胞外电子受体，并产生能量维持自身生长的过程。微生物胞外呼吸机制需要从蛋白水平来探究。在胞外电子传递过程中，微生物细胞膜上的细胞色素c(c-type cytochromes，c-Cyts)是最重要的活性物种，电子通过细胞膜上细胞色素c之间的相互作用，从微生物内部传递至细胞外膜，从而完成整个氧化还原反应。鉴于微生物胞外呼吸左右着土壤中矿物的氧化还原，并能够与重金属的迁移转化以及有机污染物的降解相偶联，在生物地球化学过程中具有重要的意义，细胞色素c的研究变得十分关键。胞外呼吸过程中电子的传递实质上是各物质间的氧化还原，然而，活体细胞色素c的氧化还原状态并不容易测量。常用的分子生物学手段，如RNA表达量分析、转录组分析等，均只能获得细胞色素c的总量变化。鉴于细胞色素c中含有大量血红素基团，该基团在410～419纳米、522纳米以及550纳米处具有较强吸收，可以采用这些吸收峰来测试细胞色素c的状态变化。因此，研究者将细胞色素c进行提取纯化，结合其光谱吸收进行表征，用于胞外电子传递机制的研究。然而，提取纯化后的细胞色素c与活体微生物外膜上的细胞色素c差异较大，
难以反映微生物功能蛋白的真实状态。测试活体微生物细胞色素c，是真实反映微生物功能蛋白状态的关键。但是活体细菌是大颗粒，在溶液中形成悬浊液，入射光经过悬液后发生散射而改变方向，使得大部分透射光无法进入检测器，难以检测实际的透射光量，带来很高的背景吸收误差，普通光谱测试无法顺利进行。积分球是一种能够对处于球内或放在球外并靠近某个窗口处的试样对光的散射或发射进行收集的一种高效率器件，近年来，利用紫外―可见光谱与积分球相连，实现了对散射光的捕获，顺利扣除散射光背景值，降低了基线噪声，从方法学上解决散射光背景吸收问题，活体细胞色素c测试得到应用。利用积分球构建紫外―可见漫透射光谱系统对悬液体系进行光谱测试，Nakamura等首次利用光谱手段获取了希瓦氏菌细胞色素c的氧化还原状态变化。然而，紫外-可见分光光度计进行宽波段的光谱测试时，必须不断调整波长进行扫描，扫描过程则需要足够的时间。以北京普析通用TU-1901型分光光度计为例，扫描速度设置为“快”，扫描间隔为“1纳米”，从600纳米扫描至300纳米，大约需要70秒。而胞外呼吸微生物外膜细胞色素c状态的变化属于秒级反应。显然利用普通分光光度计搭建的传统慢速漫透射光谱仪无法实现微生物外膜细胞色素c状态变化的实时监测。市面上，光纤光谱仪能够对200-1100nm的整个光谱进行快速数据记录，但是，虽然光纤光谱仪具有快速数据记录的功能，却尚无与光纤光谱仪联用的适用于悬液测试的积分球设备，普通光纤光谱仪对悬液体系进行测试时，将会有非常高的基线噪声，使得测试无法进行。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置。本专利技术的另一目的在于提供一种快速测定微生物外膜蛋白状态的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，包含光源、准直镜、比色皿、比色皿支架、积分球和光纤光谱仪；沿着光轴方向，光源、准直镜、比色皿支架、积分球的入射孔依次排布，其中，准直镜、比色皿支架和积分球的入射孔为紧贴着连接；比色皿设置于比色皿支架上，比色皿的宽度不小于积分球的入射孔的直径，从而光源发出的光，是通过比色皿中的待检液体后，才能完全被积分球捕获到；积分球通过光纤与光纤光谱仪连接。所述的光源包含氘灯与卤灯。所述的氘灯优选为光谱范围为190-400nm、功率为100W的氘灯。所述的卤素灯优选为光谱范围为350-2500nm、功率为10W或大于10W的卤素灯。所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置还包含变阻器，卤灯与变阻器连接，通过变阻器调节光强度。所述的比色皿的宽度略大于所述的积分球的入射孔的直径。所述的积分球为入射孔直径是9mm的积分球。所述的比色皿为宽度是10mm的比色皿。所述的比色皿优选为具有如下结构的比色皿：在比色皿的密封塞上设置进样口和出样口，从而在持续测量中的操作更为简便。所述的进样口的直径优选为1mm。所述的出样口的直径优选为1mm。所述的积分球为辐射用积分球。所述的光纤光谱仪优选为热电制冷型光纤光谱仪。所述的热电制冷型光纤光谱仪优选为Avantes的AvaSpec-ULS2048L热电制冷型光纤光谱仪。所述的比色皿与所述的比色皿支架的连接是活动连接。所述的准直镜设置于光源与比色皿支架之间，选择准直镜直接连接光源与比色皿支架而不使用光纤连接，减少了光源与比色皿之间的光强衰减，达到测试悬液体系所需的光强。所述的积分球与所述的比色皿支架紧贴相连，有利于减少散射光的损失。一种快速测定微生物外膜蛋白状态的方法，是使用上述装置实现，包括如下步骤：(1)将待检测悬液样品放置于设置于比色皿支架上的比色皿中；(2)光束由光源发出，经准直镜到达比色皿支架，经过待检测悬液样品后发生散射，由积分球捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；(3)光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。所述的待检测悬液样品优选为通过如下步骤制备得到：①将待检测的微生物菌悬液用磷酸缓冲液调节浓度；②将菌悬液置于锥形瓶中，通入惰性气体进行除氧处理；③配制乳酸钠溶液，通入惰性气体进行除氧处理；④将步骤②除氧处理后得到的菌悬液和步骤③除氧处理后得到的乳酸钠溶
液混合，得到待检测悬液样品。步骤①中所述的磷酸盐缓冲液为pH＝6.8～7.2、100～200mmol/L的磷酸盐缓冲液；优选为pH＝7、200mmol/L的磷酸盐缓冲液。所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钠缓冲液，即磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的缓冲液。步骤①中所述的浓度优选为OD600＝1.0。步骤②和步骤③中所述的惰性气体优选为氮气。步骤②和步骤③中所述的除氧处理的时间为大于20分钟。步骤③中所述的乳酸钠的浓度优选为0.5～1.5mol/L；优选为1mol/L。步骤④优选为：将3.61ml步骤②除氧处理后得到的菌悬液和0.19ml步骤③除氧处理后得到的乳酸钠溶液混合，得到待检测悬液样品。所述的微生物优选为Shewanella oneidensis MR-1。所述的微生物外膜蛋白为细胞色素c。所述的状态指的是还原状态或氧化状态。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术通过将本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：包含光源、准直镜、比色皿、比色皿支架、积分球和光纤光谱仪；沿着光轴方向，光源、准直镜、比色皿支架、积分球的入射孔依次排布，其中，准直镜、比色皿支架和积分球的入射孔为紧贴着连接；比色皿设置于比色皿支架上，比色皿宽度不小于积分球的入射孔的直径；积分球通过光纤与光纤光谱仪连接。
【技术特征摘要】
1.一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：包含光源、准直镜、比色皿、比色皿支架、积分球和光纤光谱仪；沿着光轴方向，光源、准直镜、比色皿支架、积分球的入射孔依次排布，其中，准直镜、比色皿支架和积分球的入射孔为紧贴着连接；比色皿设置于比色皿支架上，比色皿宽度不小于积分球的入射孔的直径；积分球通过光纤与光纤光谱仪连接。2.根据权利要求1所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：所述的光源包含氘灯与卤灯。3.根据权利要求2所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：还包括变阻器，卤灯与变阻器连接；所述的氘灯为光谱范围为190-400nm、功率为100W的氘灯；所述的卤素灯为光谱范围为350-2500nm、功率为不小于10W的卤素灯。4.根据权利要求1～3任一项所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：所述的积分球为入射孔直径是9mm的积分球；所述的比色皿为宽度是10mm的比色皿。5.根据权利要求4所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：所述的积分球为辐射用积分球；所述的光纤光谱仪为热电制冷型光纤光谱仪。6.根据权利要求5所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：所述的热电制冷型光纤光谱仪为Avantes的AvaSpec-ULS2048L热电制冷型光纤光谱仪；所述的比色皿为具有如下结构的比色皿：在比色皿的密封塞上设置进样口和出样口。7.一种快速测定微生物外膜蛋白状态的方法，其特征在于：是使用权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：李芳柏，吴云当，刘同旭，
申请(专利权)人：广东省生态环境技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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