本发明专利技术提供了病毒样颗粒（ＶＬＰ），其包含ｉ）含有目的多肽（ＰＯＩ）和至少禽类嗜肝ＤＮＡ病毒的大包膜（Ｌ）多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物，和ｉｉ）禽类嗜肝ＤＮＡ病毒的小包膜（Ｓ）多肽或其功能性衍生物或同源物。通过将一个或多个ＰＯＩｓ导入Ｌ多肽，所述ＰＯＩ将与Ｌ一起转运至主要由Ｓ多肽构成的颗粒结构中。本发明专利技术进一步提供了用于生产重组病毒样颗粒的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
专利
本专利技术通常涉及用于递送目的多肽至受试者的病毒样颗粒(VLPs)和编码其的核酸分子。特别地，本专利技术利用禽类嗜肝DNA病毒颗粒的特性产生稳定的重组VLPs，VLPs用于向受者递送目的多肽。所述目的多肽可包含一种或多种能引起免疫应答的抗原。包含所述目的多肽的VLPs用于将抗原递送至受试者的免疫系统或用于抗原决定部位呈递以在体外测定中检测抗体。本专利技术扩展至用于产生、生产、递送和监控本专利技术VLPs的质粒、细胞、试剂盒和方法。现有技术描述在本说明书中由著者参考的文献的详细目录汇集于说明书的结束部分。此处对于现有技术的引用(包括任何一个或多个现有技术文献)并不被认为承认或暗示所述现有技术是本领域状态的一部分。嗜肝DNA病毒是有包膜DNA病毒家族。哺乳动物嗜肝DNA病毒例如B型肝炎病毒的装配非常复杂，并且成熟的病毒体是通过预先形成的细胞质核心颗粒与在宿主内质网(ER)膜上预先装配的表面蛋白的相互作用形成的。在与包膜蛋白的合适部分相互作用后，核壳与超过1000倍空的亚病毒颗(SVPs)一起出芽进入ER的腔中并在中间体前高尔基体区室中完成装配(由Nassal，M.的综述，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，214297-337，1996)。在许多研究中，缺少核壳的病毒样颗粒(VLPs)已被证明是很有前景的候选疫苗，因为其(i)是非感染性的并因此对生产和应用是安全的，(ii)因为其提供抗原决定部位呈递的必需空间结构因此比亚单位疫苗更具免疫原性，和(iii)引起体液、细胞介导的和重要的粘膜免疫(Krueger等人，Biol.Chem.380275-276，1999)。近来成功的VLP疫苗的例子(目前正在临床实验中)是重组的乳头瘤病毒主要衣壳蛋白(L1)VLP，所述衣壳蛋白通过诱导强中和抗体应答预防感染(Frazer，Virus Research，89271-274，2002)。B型肝炎病毒(HBV)亚病毒颗粒(HBsAg-S)已被看作产生重组VLPs的候选者。几个研究已考察了适合插入外源抗原决定部位的结构域(Bruss等人，EMBO J.132273-2279，1994.，1994；Delpeyroux等人，J.Mol.Biol.195343-350，1987)，所述结构域包括preS结构域的N端融合(Prange等人，J.Gen.Virol.762131-2140，1995)。最近，携带E2包膜蛋白C型肝炎病毒(HCB)高变区1的小的35个氨基酸的插入物的颗粒已成功地引起了抗体反应(Netter等人，J.Virol.752130-2141，2001)，所述插入物插入至位于第二亲水环上的暴露的“a”决定簇。特别地，当颗粒在哺乳动物细胞体统中产生时存在着颗粒稳定性和所述HBsAg的‘a’决定簇的免疫反应性丢失所能容忍的插入片段大小的限制(Prange等，1995，同上述；Bruss等人，J.Virol.653813-3820，1991)。近来通过在酵母中表达登革热病毒/HBsAg融合体已经克服了具有巨大融合物的颗粒的不稳定性(Bisht等人，J.Biotechnology.9997-110，2002)。然而，在所有这些情况下，为了装配嵌合颗粒，重组S蛋白必须与野生型S亚单位一起装配。这些扩展的S链给包入至由所述HBsAg(包括L)形成的紧密的包膜网络中带来困难，因此它们的数目是受限的，并且对外源抗原决定部位产生的免疫应答较低。因此，需要改进的有效地整合目的多肽的VLPs。专利技术概述在整个本专利技术书和以下的权利要求中，除非上下文有另外要求，单词“包括”和变体“包含”及“含有”将被理解为表示包括所述的实体或步骤或成组的实体或步骤，但不排除任何其它的实体或步骤或成组的实体或步骤。通过序列标识号(SEQ ID NO)表示核苷酸和氨基酸序列。SEQID Nos在数字上对应序列标志<400>1、<400>2等。表1提供了序列标志概述。在权利要求之后提供了序列表。鸭B型肝炎病毒(DHBV)和其它禽类嗜肝DNA病毒的包膜蛋白由两种蛋白即大包膜蛋白(L)和小包膜蛋白(S)构成，包膜蛋白通过来自单个preS/S开放阅读框的不同框内翻译起始位点产生。L和S多肽具有共同的C端跨膜区或S结构域，而L具有大约160个氨基酸的包含受体结合区域的N端延伸(或preS结构域)。所述S多肽是主要的病毒包膜组成部分，其决定包膜的曲率并且甚至在核壳不存在的情况下可驱动颗粒分泌。相反地L多肽只能在与S共装配时被转运出去。DHBV包膜蛋白的装配和其涉及进入宿主细胞与由嗜肝DNA病毒采用的独特的拓扑学转换紧密相关，其中L蛋白的大N端preS结构域是在翻译后被转运跨越ER膜的。该过程是受调控的，这样通常只有大约50％的分子具有转运的N末端并且成熟的颗粒含有混合的内部/外部拓扑结构，包括部分转运的或中间体形式。本专利技术部分根据下列惊人的发现DHBV的L多肽的大部分区域对于L转运和颗粒装配是无关紧要的，包括在S结构中与颗粒装配所必需的S多肽的区域具有相同氨基酸序列的区域。因此，L多肽在其颗粒结合上比S多肽更加灵活并因此可进行更广泛的操作。因此本专利技术提供了主要包含小包膜(S)多肽或其功能衍生物或同源物的病毒样颗粒(VLPs)。此外，并且根据本专利技术，其包含含有目的多肽(POI)和至少大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽。因为L多肽在VLP装配期间不被排除并且因为其可在不会显著地影响颗粒稳定性的情况下被广泛地应用于运载异源多肽，本专利技术的VLP在递送目的多肽至受试者方面尤其有用。此外，由于抗原性POI的抗原决定部位被有效地展现于VLP中，所述VLPs可用于检测抗体的测定中。本专利技术对DHBV进行特别的描述，但是本专利技术也扩展至来自其它具有L和S包膜多肽蛋白的病毒的L和S多肽，其中L不会从颗粒装配中被排除。例如，也涉及来自其它禽类嗜肝DNA病毒的L和S多肽，包括例如但不限于苍鹭(HHBV)、雪雁(SGHBV)和与DHBV表现相似亚颗粒形态学即具有L和S包膜蛋白的嗜肝DNA病毒。在所有嗜肝DNA病毒中L和S多肽的S结构域高度保守，例如在TM1和TM2之间的区域表现出高达70％的氨基酸相似性。本专利技术提供了病毒样颗粒(VLP)，其包含i)包含目的多肽和至少禽类嗜肝DNA病毒的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的多肽，和ii)禽类嗜肝DNA病毒的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。本专利技术进一步提供病毒样颗粒(VLP)，其包括i)包含目的多肽(POI)和至少DHBV的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽，和ii)DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。通过将一个或多个POIs引入L多肽，所述POI与L一起被转运入主要由S多肽构成的颗粒结构中。尽管提供了几个L多肽颗粒结合部分的例子，但根据此处提供的教导，产生更小或更大的L多肽部分和确定其与目的异源(或内源)蛋白一起是否能在VLP内结合成颗粒在本领域普通技术人员的技术范围之内。因此，本专利技术绝不受限于作为示例的构建体。本专利技术的病毒样颗粒用于疫苗组合物以提高有效的免本文档来自技高网...
【技术保护点】
病毒样颗粒（ＶＬＰ），其包含含有目的多肽（ＰＯＩ）和至少大包膜多肽（Ｌ）的颗粒结合部分的融合多肽。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：DA安德森，EVL格伽茨克，
申请(专利权)人：赫普吉尼克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]
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