本发明专利技术涉及一种由包含微颗粒作为生物亲和性结合固相，标以双光子荧光染料的生物特异第二试剂的生物流体或悬浮液测量分析物的无分离生物分析方法，包括：将激光聚焦到反应悬浮液中，当单个微颗粒无规漂浮或被激发激光的辐射压力引导通过焦点区的激光束时由其测量双光子激发荧光，其中使用一种双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料。该染料具有结构（Ⅱ）；和至少一个基团Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］，Ｒ↓［３］，Ｒ↓［４］，Ｒ↓［５］，Ｒ↓［６］或Ｒ↓［７］被取代得到一种可用于选择共价键接到其它分子上的化学反应性基团，和至少一个基团Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］，Ｒ↓［３］，Ｒ↓［４］，Ｒ↓［５］，Ｒ↓［６］或Ｒ↓［７］ｐ被取代得到一种水增溶基团。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术的领域本专利技术涉及二吡咯亚甲基二氟化硼染料和这些染料在双光子激发下的应用。另外本专利技术涉及二吡咯亚甲基二氟化硼染料和其轭合物在基于双光子激发的生物分析中的应用。本专利技术的背景本文所用的说明本专利技术的背景的出版物和其它材料，和尤其是，用于提供关于实践的补充细节的事例在此作为参考并入。二吡咯亚甲基二氟化硼染料二吡咯亚甲基二氟化硼染料已首次由Treibs和Kreuzer在Liebigs Ann.Chem.718(1968)208和由Wories H.J.等人在Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 104(1985)288中描述。自此二吡咯亚甲基二氟化硼染料已找到各种用途。二吡咯亚甲基二氟化硼染料在光谱的可见区域具有强荧光。二吡咯亚甲基二氟化硼染料具有以下的综合性能高量子效率，尖锐的吸收和发射带和高吸收系数。各种各样的二吡咯亚甲基二氟化硼染料目前是市售的(Haugland R.P.，荧光探头和研究化学品手册，第六版，分子探头，Eugene，OR，1996)。这些染料的不同衍生物的合成和荧光性能已在出版物和专利中描述。US 4,916,711，US 5,189,029，US 5,446,157和EP 0 361936(Morgan和Boyer)描述了二吡咯亚甲基二氟化硼染料在光致荧光的治疗(PDT)中和在产生激光时的应用。根据Morgan和Boyer的描述，二吡咯亚甲基二氟化硼染料具有低三线态-三线态吸收以及低激光作用阈值，能够产生强度高于使用常规激光染料时的激光束。另外这些染料的高光稳定性导致染料材料减少降解。荧光染料广泛用作示踪剂，通过荧光显微镜检查用于生物结构的定域，通过荧光免疫分析用于分析物的定量，用于细胞的流动血细胞计数分析和用于许多其它场合。通常这些荧光染料通过共价键连接到生物分子上。为了该连接(标记)，这些染料需要一种官能团，它可与生物分子中的另一官能团反应。常用的反应性官能团包括反应性羧酸酯，酸酐，肼和异硫氰酸盐。US 4,774,339描述了二吡咯亚甲基二氟化硼染料作为荧光标签的用途。根据US 4,774,339，二吡咯亚甲基二氟化硼染料的荧光性能对溶剂或pH不敏感。这些染料还具有窄的吸收和发射带宽度，高量子产率和高光稳定性。二吡咯亚甲基二氟化硼染料的基本发色团(I)具有吸收和发射最大值约500nm。 二吡咯亚甲基二氟化硼染料的基本发色团二吡咯亚甲基二氟化硼染料的吸收和发射波长通常可通过改变发色团的取代基而改变。π-电子共轭的延长导致发射和吸收带移向较长的波长。π-电子共轭的延长也影响光稳定性，溶解度和荧光量子产率。US 5,274,113，US 5,451,663和WO 93/09185描述了具有吸收最大值525nm-650nm的二吡咯亚甲基二氟化硼标记试剂。吸收和发射波长的这种位移已通过将不饱和有机基团加入发色团而实现。这些专利描述了芳基，杂芳基和链烯基取代基用于延长π-电子共轭路径的用途。US 5,248,782描述杂芳基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料和US 5,187,288描述具有吸收最大值550nm-670nm的乙烯基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。吸收和发射波长的位移在大多数情况下伴随增加吸收系数和光稳定性。π-电子共轭路径的延长另外由Chen J.等人描述于J.Org.Chem.，65(2000)2900。Chen J.等人描述了具有吸收最大值620-660nm和荧光发射630-680nm的芳基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。US 5,433,896描述了包含稠合芳基取代基的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。这些二苯并吡咯亚甲基二氟化硼染料具有吸收和发射最大值600nm-740nm。这些染料的摩尔吸收系数最通常超过100 000cm-1M-1。Wories H.J.等人在Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 104(1985)28中描述了一种用于将磺酸基团引入二吡咯亚甲基二氟化硼染料和因此增加这些染料的亲水性的方法。他们报道了具有吸收最大值495nm-491nm，和发射最大值515-510nm的单-和二磺化二吡咯亚甲基二氟化硼染料。二吡咯亚甲基二氟化硼染料已作为荧光标签用于各种场合。这些染料的合成和多用途已在以上提及的出版物和专利中报道。但这些染料大多数具有固有憎水性，这限制了它们用于生物分子的荧光标记。对于包含芳基取代基的二吡咯亚甲基二氟化硼染料，情况尤其如此。二吡咯亚甲基二氟化硼染料不仅可用作荧光标记，而且可用作激光染料和在光致荧光的治疗中用作探头用于治疗瘤。这些染料还可用于微颗粒的染色(US 5,723,218)和用作光学记录介质(US6,060,606)。双光子激发在1931年，Maria Gppert-Mayer(Ann.Phys.9(1931)273)推断，分子可同时吸收两个光子。该现象长期保持没有实际用途，直至可得到强激光源。双光子激发这样产生通过聚焦强光源，单位量和单位时间的光子的密度变得足够高使得双光子同时被吸收到同一的发色团中。吸收的能量是双光子的能量的总和。双光子激发的可能性取决于光子密度的二次幂。双光子的吸收因此是一个二级的非线性过程。一个发色团对两个光子的同时吸收得到处于激发态的发色团。该激发态可通过发射能量高于照射激光光子的光子而松弛。在本文中包括双光子激发和随后辐射松弛的过程称作双光子荧光。双光子荧光具有通常类似于同一发色团的单光子激发荧光的光谱性能(Xu C.和WebbW.W.，J.Opt.Soc.Am.B，13(1996)481)。可用两个同时吸收的光子激发和激发态松弛伴随荧光发射的分子在本文中称作双光子荧光染料。双光子激发的一个主要特征在于，激发仅在焦点的明显受限的3维(3D)附近进行。该特点来自所产生的荧光发射的高3D空间定域。由于激发的非线性性质，在样品周围和在光学元件中在焦点之外产生最小的本底荧光。双光子激发的另一主要特征在于，照射和发射在基本上不同的波长范围内进行。该性能导致泄露到检测通道中的散射的照射光可容易通过使用低通滤波器而减弱(减弱至少10个数量级)。因为激发量非常小，双光子激发最适用于观察小样品量和结构。双光子激发的固有性能(低本底和小激发量)表明，双光子激发最适用于需要由少量物质进行荧光检测的场合。实际上双光子激发量是几个毫微微升的量或甚至更低，取决于体系的光学参数。在这种小激发量下，仅少数荧光分子在任何给定时间点上存在。涉及双光子激发技术的固有特点之一是荧光团的低吸收横截面。另一特点是，双光子激发通常进行使用脉冲激光进行，使用常规激光的脉冲间的时间长于荧光团的寿命时间，导致降低的激发速率。这些特点以及小激发量导致较低的信号水平。另一问题涉及可造成意外作用的强照射强度。这些作用可分成两种不同的类型累计多脉冲作用(能量的积聚)和单脉冲作用(二级或更高级的直接非线性吸收)。累计多脉冲作用在使用具有高重复率的脉冲激光(具有重复率约100MHz数量级的亚微微秒脉冲激光)时尤其相关。在这种高重复率下，能量有可能集聚成染料分子的长寿命三线态。三线态通常是非辐射的和因此能量至这些状态的集聚降低了双光子荧光产率。双光子激发效率(Ex2ph)与激光的峰功率(Pp)和脉冲持续时间(τ脉冲)成比例(Ex2p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种由包含微颗粒作为生物亲和性结合固相，标以双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的生物特异第二试剂的生物流体或悬浮液测量分析物的无分离生物分析方法，包括：将激光聚焦到反应悬浮液中，当单个微颗粒无规漂浮或被激发激光的辐射压力引导通过焦点区的激光束时由其测量双光子激发荧光，特征在于所述双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料具有结构（Ⅱ）， ＊＊＊ （Ⅱ）， 其中至少一个基团Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］，Ｒ↓［３］，Ｒ↓［４］，Ｒ↓［５］，Ｒ↓［６］或Ｒ↓［７］是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，异噁唑基，氧杂二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，吲哚基，共轭乙烯基，二烯基或三烯基；和至少一个基团Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］，Ｒ↓［３］，Ｒ↓［４］，Ｒ↓［５］，Ｒ↓［６］或Ｒ↓［７］被取代得到可用于选择共价键接到其它分子上的化学反应性基团；和至少一个基团Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］，Ｒ↓［３］，Ｒ↓［４］，Ｒ↓［５］，Ｒ↓［６］或Ｒ↓［７］被取代得到水增溶基团；和剩余的基团Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］，Ｒ↓［３］，Ｒ↓［４］，Ｒ↓［５］，Ｒ↓［６］和Ｒ↓［７］分别独立地选自氢，卤素，烷基，氰基，和羧基，分别可任选地被取代。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：N梅尔托拉，A索伊尼，
申请(专利权)人：北极医疗诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：FI[芬兰]
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