本发明专利技术公开了一种检测细胞内CO的荧光探针及其制备方法和应用，一种检测细胞内CO的荧光探针，结构式如下：其中，R为H、-CH3、-CH2CH3或-COOEt。本发明专利技术合成新型环钯基团能够对CO的响应性更快更灵敏，其与BODIPY结合后不仅提高了对CO的选择性，而且实现更快更灵敏的检测CO。其制备方法是对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，或对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反应生成硝基苯基氟硼二吡咯(硝基苯基BODIPY)，然后将硝基苯基BODIPY中的硝基还原成氨基，再加入亚硝酸盐和3,5-二甲基苯酚偶氮化反应，最后加入钯盐进行环钯化反应得到目标产物，即检测细胞内CO的荧光探针(ACP-CO)。本发明专利技术合成方法简单，适于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种荧光探针，特别涉及一种BODIPY类荧光探针、其合成方法及其在检测细胞内CO的应用，属于检测
技术介绍
多年来，一氧化碳(carbonmonoxide，CO)因其极易与血红蛋白结合，形成碳氧血红蛋白，使血红蛋白丧失携氧的能力和作用，造成组织窒息，严重时死亡。一直以来，CO被人们认为是一种有毒气体。20世纪70年代，人们发现机体可以内源性产生CO，它在体内主要是由血红素氧化酶酶解血红素产生。CO与其它气体信号小分子NO、H2S一样，在机体调节的生理和病理方面都起着重要作用。CO的主要生理作用是为心肌局部缺血和再灌注时组织损伤提供保护。相比传统直接给机体吸入CO气体，过渡金属羰基复合物的CO释放分子(CORMs)被认为是临床上防止心肌局部缺血和再灌注时组织损伤的潜在药物。内源性气体信号分子因其具有持续产生、传播迅速等特别。目前的CO检测技术，如硫酸钯-钼酸铵比色式法、电化学法、气相色谱法、红外线一氧化碳检测法等，往往需要延后处理或破坏的组织或产生细胞裂解产物。近年来，用于检测体内CO的荧光探针，比较少见。如以BODIPY为荧光母体(BrianW.Michel,AlexanderR.Lippert,andChristopherJ.Chang,J.Am.Chem.Soc.2012,134,15668-15671)探针，以及以双光子染料香豆素衍生物为荧光母体(K.Zheng,W.Lin,L.Tan,H.ChenaandH.Cuia,Chem.Sci.,2014,5,3439-3448.)的荧光探针。以上两种探针的响应基团都是以苄胺形成的环钯化物，虽然选择性好，但反应时间长(1h或30min)。
技术实现思路
为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种检测细胞内CO的荧光探针及其制备方法和应用，该类荧光探针结构新颖、灵敏度高、光稳定性好。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种检测细胞内CO的荧光探针，结构式如下：其中，R为H、-CH3、-CH2CH3或-COOEt。本专利技术合成新型环钯基团能够对CO的响应性更快更灵敏，其与BODIPY结合后不仅提高了对CO的选择性，而且实现更快更灵敏的检测CO。一种检测细胞内CO的荧光探针的制备方法，将对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，或对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反应生成硝基苯基氟硼二吡咯(硝基苯基BODIPY)，然后将硝基苯基BODIPY中的硝基还原成氨基，再加入亚硝酸盐和3,5-二甲基苯酚偶氮化反应，最后加入钯盐进行环钯化反应得到目标产物，即检测细胞内CO的荧光探针(ACP-CO)。本专利技术合成方法简单，适于工业化生产。优选的，所述二甲基吡咯为2,4-二甲基吡咯。其反应过程如下：其中，R为H、-CH3、-CH2CH3或-COOEt。优选的，步骤如下：(1)将对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍生物溶解于溶剂1中，加热回流后冷却，加入溶剂2，加入三氟化硼乙醚升温反后得到5,5-二氟-1,3,7,9-四甲基-10-(4-硝基苯基)-5H-4λ4,5λ4-二吡咯[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮杂硼，即硝基苯基BODIPY；(2)将硝基苯基BODIPY和甲酸铵溶于溶剂中，然后加入Pd/C搅拌反应后即得氨基苯基BODIPY；(3)将氨基苯基BODIPY和浓盐酸溶于溶剂中，加入亚硝酸盐溶液，搅拌后，加入3,5-二甲基苯酚的碱溶液搅拌后得到偶氮BODIPY；(4)将偶氮BODIPY染料溶解于溶剂中，然后加入PdCl2，室温搅拌过夜后，即得检测细胞内CO的荧光探针。进一步优选的，所述步骤(1)的具体步骤为：将对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍生物溶解于CH2Cl2中，加热回流1-2h，冷却后加入三乙胺、甲苯，待反应10-20分钟后加入三氟化硼乙醚，升温至50-60℃反应2-4小时，旋干，用色谱柱分离，所得固体即硝基苯基BODIPY；所述的硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯或二甲基吡咯衍生物、三乙胺、甲苯、三氟化硼乙醚及CH2Cl2的用量比为7-10：7-20：3.5-5.5：30-50：3-6：20-50(g：g：mL：mL：mL：mL)；色谱柱分离洗脱剂比例为V石油醚：V二氯甲烷＝4-6：1。提高原料的转化率，同时提高硝基苯基BODIPY的产率和纯度。进一步优选的，所述步骤(2)的具体步骤为：将硝基苯基BODIPY、甲酸铵溶于CH2Cl2，然后加入Pd/C，常温搅拌1-3小时后过滤，将滤液旋干得氨基苯基BODIPY；所述的硝基苯BODIPY、甲酸铵、Pd/C、CH2Cl2的用量比例为：5～10：50～70：1～5:10-30(g：g：g：mL)。提高原料的转化率，同时提高氨基苯基BODIPY的产率和纯度。进一步优选的，所述步骤(3)的具体步骤为：将氨基苯基BODIPY、浓盐酸溶于DMF中，加入亚硝酸钠水溶液，在0-5℃下搅拌3-4h，然后将其缓慢滴加到3,5-二甲基苯酚的NaOH溶液中，在0-5℃下搅拌4-5h，过滤后的滤渣色谱柱分离，得黄色固体偶氮BODIPY；所述的氨基苯基BODIPY、浓盐酸、DMF、亚硝酸钠、3,5-二甲基苯酚、NaOH、水的用量比为1-3：3-5：10-15：3-5：3-5：4-8：20-30(g：mL：mL：g：g：g：mL)。色谱柱分离洗脱剂比例为V二氯甲烷：V石油醚＝1-3：2。提高原料的转化率，同时提高偶氮BODIPY的产率和纯度。进一步优选的，所述步骤(4)中的溶剂为CH3OH；所述的偶氮BODIPY、CH3OH、PdCl2的用量比例为5～10：10～30：10～20(g：mL：g)。提高原料的转化率，同时提高检测细胞内CO的荧光探针的产率和纯度。一种上述检测细胞内CO的荧光探针在检测细胞内CO中的应用。一种检测细胞内CO的方法，步骤为：(1)将上述检测细胞内CO的荧光探针溶解于生理盐水、缓冲溶液或者培养液中，配制成储备液储存待用；(2)将步骤(1)中的储备液加入含有细胞组织的适当缓冲液进行测试。一种检测活细胞内CO的方法，步骤为：(1)将含有上述检测细胞内CO的荧光探针的缓冲溶液5-10μM加入培养好的细胞放于培养箱是孵育8-12分钟；(2)将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像，如果是检测内源性物质，刚是直接进行共聚焦成像，而如果是外加检测的，刚是加了待检测物质后，再次孵育8-12本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测细胞内CO的荧光探针，其特征是，结构式如下：其中，R为H、‑CH3、‑CH2CH3或‑COOEt。
【技术特征摘要】
1.一种检测细胞内CO的荧光探针，其特征是，结构式如下：
其中，R为H、-CH3、-CH2CH3或-COOEt。
2.一种检测细胞内CO的荧光探针的制备方法，其特征是，将对硝基苯甲酰氯、二甲基
吡咯和三氟化硼乙醚，或对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反应生成硝
基苯基氟硼二吡咯，然后将硝基苯基BODIPY中的硝基还原成氨基，再加入亚硝酸盐和3,5-
二甲基苯酚偶氮化反应，最后加入钯盐进行环钯化反应得到目标产物，即检测细胞内CO的
荧光探针。
3.如权利要求2所述的一种检测细胞内CO的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤如下：
(1)将对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍生物溶解于
溶剂1中，加热回流后冷却，加入溶剂2，加入三氟化硼乙醚升温反后得到5,5-二氟-1,3,7,9-
四甲基-10-(4-硝基苯基)-5H-4λ4,5λ4-二吡咯[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮杂硼，即硝基苯基
BODIPY；
(2)将硝基苯基BODIPY和甲酸铵溶于溶剂中，然后加入Pd/C搅拌反应后即得氨基苯
基BODIPY；
(3)将氨基苯基BODIPY和浓盐酸溶于溶剂中，加入亚硝酸盐溶液，搅拌后，加入3,5-
二甲基苯酚的碱溶液搅拌后得到偶氮BODIPY；
(4)将偶氮BODIPY染料溶解于溶剂中，然后加入PdCl2，室温搅拌过夜后，即得检测
细胞内CO的荧光探针。
4.如权利要求3所述的一种检测细胞内CO的荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤
(1)的具体步骤为：将对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍
生物解于CH2Cl2中，加热回流1-2h，冷却后加入三乙胺、甲苯，待反应10-20分钟后加入三
氟化硼乙醚，升温至50-60℃反应2-4小时，旋干，用色谱柱分离，所得固体即硝基苯基
BODIPY；
所述的硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯或二甲基吡咯衍生物、三乙胺、甲苯、三氟化硼乙
\t醚及CH2Cl2的用量比为7-10：7-20：3.5-5.5：30-50：3-6：20-50，g：g：mL：mL：mL：
mL；色谱柱分离洗脱剂比例为V石油醚：V二氯甲烷＝4-6：1。
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【专利技术属性】
技术研发人员：唐波，王栩，李勇，解希雷，李萌萌，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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