本发明专利技术涉及一种用于检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的荧光探针的制备方法和应用，属于化学分析检测技术领域。其分子结构如下：该探针分子最大吸收波长在368nm，探针分子与半胱氨酸或同型半胱氨酸作用后，荧光光谱在585nm处强度由无到有并不断增强，表现出较大斯托克斯位移(Stokes shifts)能够提高检测的灵敏度；发射波长在近红外能够减少探针检测过程中的背景荧光和活细胞的光损伤。本发明专利技术所述的探针分子检测灵敏度较高，对含巯基氨基酸识别能力强，响应速度较快，抗干扰能力强，该类探针在生物化学等领域具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学分析检测
，具体涉及一种可以检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的新型红光-近红外荧光探针的制备方法以及其在体外和活细胞内部检测半胱氨酸和同型半胱氨酸方面的应用。
技术介绍
生物巯基化合物，半胱氨酸(Cysteine，Cys)，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)和谷胱甘肽(Glutataione，GSH)等在生物的生理和病理过程中发挥着重要的调节作用。半胱氨酸是参与生命体的蛋白质合成，解毒作用以及新陈代谢过程的必需氨基酸。研究表明，半胱氨酸过高与神经毒性有密切关系，而半胱氨酸过低又与生长缓慢，嗜睡，肝损伤，皮肤损害等相关联。同型半胱氨酸与各种血管和肾脏疾病有关。同型半胱氨酸过高会增加获心血管疾病和阿尔采默病的风险。谷胱甘肽是人体内氧化还原作用和解毒作用是否正常运作的指示剂，并与白细胞减少，癌症，艾滋病病毒感染等有密切联系。因此研究有效的生物硫醇的检测技术在化学，生物学，以及医学领域都非常重要。由于荧光探针具有操作简单，无辐射，高灵敏度和高分辨率的优势，使其成为检测生物硫醇的理想选择。目前，已经报道了多种具有高灵敏度检测生物硫醇的荧光探针。然而大部分这类探针是基于硫原子的强亲核性，因此它们对半胱氨酸以及同型半胱氨酸的检测难以抵制其他硫醇的干扰。并且多数这类探针还有短发射波长和小斯托克斯位移(Stokesshifts)的缺点。然而长得发射波长能够减少探针检测过程中的背景荧光和活细胞的光损伤，大斯托克斯位移能够提高检测的灵敏度。至今还没有报道过一种具有大斯托克斯位移，用于检测半胱氨酸和同型半胱氨酸，基于丙烯酰脂的红光-近红外荧光探针。
技术实现思路
本专利技术之一目的在于提供一种合成简单、反应温和、产率较高、成本较低的荧光探针合成方法；本专利技术之另一目的是提供一种好选择性、高灵敏度，强抗干扰能力，大斯托克斯位移(Stokesshifts)，发射波长在近红外，能够对体外或者活细胞内部的半胱氨酸和同型半胱氨酸进行监测或者细胞荧光成像的荧光探针。本专利技术解决问题采取的技术方案为，一种荧光开关(off-on)法识别半胱氨酸和同型半胱氨酸的新型荧光探针，其分子结构式如下：合成路线如下：具体合成方法如下：(a)在50ml圆底烧瓶中，将3-硝基邻苯二甲腈(2.0g，11.6mmol)，K2CO3(1.8g，12.7mmol)和NaNO2(0.8g，11.6mmol)溶于二甲基亚砜中(30mL)，130℃油浴搅拌回流30min，反应完成。冷却至室温，加入90ml蒸馏水稀释反应液，用2M盐酸酸化至PH＝3，产生沉淀，抽滤，用蒸馏水和甲醇洗涤滤饼，真空干燥，冰醋酸重结晶进一步纯化得到棕色晶体。即得中间产物3-羟基邻苯二甲腈。产量：0.9g。收率54％。(b)在25ml圆底烧瓶中，将上步所得产物(288mg，2mmol)，2-氨基吡啶(385mg，4.1mmol)和CaCl2(46mg，0.41mmol)溶于正丁醇(6mL)中。氩气保护，110℃油浴加热回流5天，反应完全，冷却至室温，真空旋蒸除去正丁醇，水洗，常压过滤，滤饼真空干燥，经柱层析纯化得到产物，真空干燥过夜，得到橘黄色粉末。即得中间产物羟基染料4。产量：141.6mg。收率25％。(c)将上步所得产物(79.25mg，0.25mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，再加入三乙胺(0.07mL，0.5mmol)，冰浴下逐滴加入溶于4ml无水二氯甲烷的丙烯酰氯(58.16mg，0.31mmol)，氩气保护，室温搅拌下反应10分钟，反应完全，冰浴下旋蒸除去二氯甲烷，快速柱层析分离得到黄色粉末。即得探针分子。产量：75.31mg。收率：81.2％。本专利技术的荧光探针的作用机理如下，由于丙烯酸酯部分的光诱导电子转移(PET)，探针分子没有荧光。半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)能够与探针分子中丙烯酸酯的双键发生亲核加成反应得到硫醚衍生物，半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)反应后得到的硫醚衍生物能够通过分子内合环脱去硫醚部分恢复羟基染料4，探针分子由无荧光变成很强的红色荧光，谷胱甘肽(GSH)反应后得到的硫醚衍生物因为中间产物的动力学禁阻而无法发生分子内合环反应。从而实现特异性检测半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)的目的。探针分子的响应过程如下：高效液相色谱验证了此响应机理，探针分子和对应的羟基染料4液相色谱图中各自在15分钟和24.57分钟出现单峰。当用0.5倍当量半胱氨酸(Cys)处理探针分子后，15分钟的探针分子峰减弱的同时，24.57分钟出现染料4的单峰。用5倍当量半胱氨酸(Cys)处理探针分子后，15分钟的探针分子峰完全消失，只留下24.57分钟的染料分子峰。本专利技术的荧光探针在近红外发射，其与半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)作用前无荧光，作用后荧光发射峰在585nm处。本专利技术的荧光探针具有大斯托克斯位移(Stokesshifts)，最大吸收在368nm，与半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)作用后最大发射在585nm，斯托克斯位移(Stokesshifts)为217nm。本专利技术的荧光探针选择性好。探针分子的测试体系为含有1.0mM的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，PH为7.4的10mM的PBS缓冲溶液，室温下测量。探针分子本身没有荧光，在加入5倍当量半胱氨酸(Cys)之后，在最大发射波长585nm处荧光强度增大了86倍，加入5倍当量半胱氨酸(Hcy)之后，荧光强度增大了84倍。而在加入同样当量的GSH和其他生理氨基酸(Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，IIe，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，andThr)后，荧光只有几乎可以忽略的增加。本专利技术的荧光探针抗干扰能力强，其他生理氨基酸(Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，IIe，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，andThr)的存在不影响探针分子与半胱氨酸(Cys)的作用。本专利技术的荧光探针灵敏度高，探针分子的荧光强度随着半胱氨酸(Cys)浓度的增加逐渐增加，直到达到最大值。半胱氨酸(Cys)浓度在低浓度(0-7uM)与探针分子的荧光强度成很好的线性关系。检测限为5.6nM。可见本专利技术的探针分子可以用于在水相中检测半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)。本专利技术的荧光探针对半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针的合成与应用，其结构为：
【技术特征摘要】
1.一种识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针的合成与应用，其结构为：
2.根据权利要求1所述的识别半胱氨酸和同...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋相志，田惠惠，杨大雷，刘兴江，齐风佩，杨雷，谭倩，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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