农药西维因快速检测用试纸条及其制作方法与应用技术

农药西维因快速检测用试纸条及其制作方法与应用，涉及西维因特异性抗体、及其在固相载体膜上的固定化技术、固相载体膜的处理技术以及在样品检测中的应用。它克服了目前试纸条产品，抗体固定化技术繁琐复杂、成本较高，分析灵敏度较低、精确度和准确度较差，结果不稳定等问题。本发明专利技术试纸条为浸有农药西维因抗体的经特殊处理的醋酸纤维膜。它是以高特异性西维因抗体为免疫检测抗体，采用直接竞争酶联免疫检测法，通过溶液流过、浸沾的手段，使抗体、待测样品和酶标抗原在短时间内完成反应，获得检测结果，具有良好的抗干扰能力，检测精度高。本发明专利技术还提供了简便、快速、灵敏、准确的试纸条分析技术，具有良好的应用前景，既有经济效益又有社会效益。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析
；涉及有机合成，免疫化学，生物化学及物化测试等技术；主要应用在农药残留快速免疫分析方面。
技术介绍
西维因(亦称甲萘威)是氨基甲酸酯类农药的代表性商品。在我国西维因可用于141种作物，防治565种害虫，是目前注册范围最广的杀虫剂。西维因被广泛应用于蔬菜、棉花、大田粮食作物，在果树上甲萘威被用作疏花剂，在水产养殖中用于鱼塘有害生物的防除。由于西维因在我国使用广泛，我国许多农产品中存在西维因残留。随着农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应，日益受到人们关注和担忧。为此，对农药残留的限制也因此越来越严格，并且对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面，都提出新的要求和更高的标准。我国对于西维因在农产品中的残留量，有较严格的检测标准。按照GB 5009.21对粮、油、菜中甲萘威残留量的规定粮食≤5.0mg/kg，蔬菜≤2.0mg/kg，水果≤2.5mg/kg，食用油≤0.5mg/kg，烟草≤1.0mg/kg。然而，由于分子量小于1000dolton(道尔顿)的小分子有毒化学品，如农药及其代谢产物，其传统的残留分析方法，主要是依靠气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或质谱等物化分析手段。该传统的理化分析方法，繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，难以满足实际分析的需要，因此迫切要求发展简便、快速、灵敏的分析技术。1967年Centen等人制备的农药马拉硫磷的抗血清，自此免疫分析技术被引入农药残留分折领域。免疫分析技由于具有快速、简便、灵敏的特点而成为一种最有发展和应用潜力的分析技术之一，受到广泛的重视。基于抗原抗体免疫反应检测小分子化和物的分析技术，目前多采用酶联免疫分析(ELISA)。利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度，近年来发展很快。80年代以来发展起来的农药ELISA和简易酶免疫EIA技术，使农药残留分析在方法上获得更大的生命力；对使用快速分析样本基质过于复杂，用普通理化方法难以分析的农药残留，具有相当的应用价值。酶联免疫检测技术可以用于定量和定性检测。目前广泛使用的各种农药残留实验室酶联免疫快速检测技术和快速检测试剂盒基本上都是定量检测，而试纸条技术属于定性检测技术。试纸条与试剂盒相比较具有更加易于携带、检测更加迅速。在实际检测过程中，特别是现场快速检测，并不一定需要对每个样品都获得定量数据而只需要定性的判别出某个样品是否含有某种农药，含量是否超标既可以。因此只需要几分钟或十几分钟就可以获得结果的快速检测试纸条是最为合适的检测工具。目前市售的商品化试纸条绝大多数是采用胶体金技术，这种试纸条生产技术复杂，成本高因而价格一般比较昂贵，而且胶体金技术在大分子(如蛋白质)检测方面有着技术性能较为出色，但是在小分子检测上还不能很好的应用，在检测精确度、稳定性方面还需要改进，因此目前我们急需要一种性能稳定、价格低廉的小分子物质免疫快速检测试纸条技术和相关产品。
技术实现思路
需要解决的问题针对上述问题，本专利技术的目的是，填补当前尚未有农药西维因快速检测试纸条的空白。提供一种简易、快速、抗体特异性好、检测灵敏度高的现场定性检测试纸条和方法。技术方案本专利技术利用醋酸纤维膜作为固相载体，将抗体在膜上进行固定化处理，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性、定量地检测样本中超微量西维因。该技术研究的关键是抗体的固定化处理技术和固相表面免疫反应技术。农药西维因快速检测试纸条，它是浸有农药西维因抗体的条状固相载体膜；其中固相载体膜，是经浓度为40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡预处理的醋酸纤维膜，农药西维因抗体推荐采用200410020332.2号专利中的西维因抗体，其抗体具有特异性好，检测灵敏度高等特点，其抗体浓度为1∶200000-400000的高特异性农药西维因抗体。该检测试纸条包括插入式快速检测试纸条和垂直流过式快速检测试纸条两种，其规格分别为1.8-2.2cm×4.5-9.0cm和1.5cm×1.0cm。农药西维因快速检测试纸条的制作方法，是将西维因抗体，经过点样、固定、封闭、冲洗工序固定到经过预处理的固相载体膜上。其具体做法如下方法一·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡10-30分钟后，取出紧贴于用双蒸水润湿的滤纸上，其具体做法是将滤纸用双蒸水润湿后，甩掉多余的水分，紧贴于平滑的塑料板上，然后将用Tris缓冲液已浸泡好的固相载体膜，贴在湿润的滤纸上，确保膜与滤纸之间紧贴无气泡，避光晾干；然后剪成条状，其规格为1.8-2.2cm×4.5-9.0cm，再用笔在固相载体膜上等分出3-6个点样区域，并在每个点样区的中心部位，画出直径为6-10mm的圆形反应区。·点样用微量加样枪将50μl浓度为1∶200000-400000的高特异性农药西维因抗体西维因抗体，点加于上述处理好的条状固相载体膜上，且必须点于该膜圆形反应区的中心部位。需要说明的是我们推荐采用200410020332.2号专利申请中的西维因特异性抗体。·固定点样完后，先在室温下固定5-10分钟，再在30℃的恒温箱中固定40-60分钟，让抗体在固相载体膜上充分固定。·封闭将固定好的抗体的固相载体膜浸泡在1.5％的白明胶磷酸缓冲液溶液中5-10分钟，在30℃的恒温箱中封闭10-20分钟；·冲洗将封闭好的固相载体膜，用含0.5ml/L吐温-20的磷酸缓冲液(PBS)缓冲液即PBST洗涤液冲洗三次，轻轻甩掉多余的水分，30℃下放置20分钟干燥，或将冲洗完后的膜冻干，于4℃下密闭保存。通过以上工序即完成了农药西维因快速检测试纸条的制作。该方法所制作的试纸条，为垂直流过式快速检测试纸条。方法二·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡10-30分钟后，取出避光晾干；然后剪成条状，其规格为2.5-3.5cm×15-16cm；·点样用自动点样仪将50-100μl西维因抗体涂布在经过上述预处理的固相载体膜上，然后用小刀将该膜切割成规格为1.5cm×1.0cm小试纸条，其它同方法一。；·固定点样完后，先在室温下固定5-10分钟，在30℃的恒温箱中固定40-60分钟，让抗体在固相载体膜上充分固定。·封闭将固定好的抗体的固相载体膜浸泡在1.5％的白明胶磷酸缓冲液溶液中5-10分钟，然后在30℃的恒温箱中封闭10-20分钟；·冲洗将封闭好的固相载体膜，用含0.5ml/L吐温-20的PBS缓冲液即PBST洗涤液冲洗三次，用滤纸吸干多余的水分，30℃下放置20分钟干燥或将冲洗后的膜冻干，于4℃下密闭保存。；通过以上工序即完成了农药西维因快速检测试纸条的制作。该方法所制作的试纸条，为插入式快速检测试纸条。农药西维因快速检测试纸条在检测西维因残留中的应用，其具体做法是西维因酶标抗原与将待测样品按体积比1∶10-50混合，作为待测混合液，另取西维因酶标抗原与10％甲醇，按体积比1∶10-50本文档来自技高网...

【技术保护点】
农药西维因快速检测试纸条，其特征在于它是浸有农药西维因抗体的条状固相载体膜，其中固相载体膜是经过４０－１００ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０－７．２，含０．６－１．０％的ＮａＣｌ的Ｔｒｉｓ缓冲液浸泡预处理的醋酸纤维膜。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王硕，王俊平，张燕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]