本发明专利技术涉及一种多糖定量检测方法及系统。该方法是先将多糖经色谱柱分离后进行水解再与荧光衍生化试剂反应，通过荧光检测器对生成的荧光衍生物的测定，获得多糖的含量。本发明专利技术用于多糖检测的系统依次包括高效液相色谱柱、水解反应器、荧光衍生化反应器、冷却管、荧光检测器和工作站或记录装置。本发明专利技术检测系统通过先对多糖进行水解，再与荧光衍生化试剂反应，大大提高了检测的灵敏度，适合于各种类型的多糖含量的定量检测，其检测限可达几十ｎｇ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物分析领域。具体涉及一种多糖定量检测方法及系统。
技术介绍
目前，用于多糖含量测定的方法主要有显色法、同位素标记法、免疫学法、生物检定法、高效液相色谱(HPLC)—示差检测法和蒸发光散射检测法等。显色法检测限约10μg，且专属性差。同位素标记法、免疫学法及生物检定法检测限均可＜10ng，但均存在不能同时测定代谢产物的缺点。同位素标记法不适合于人体的药代研究，且标记可能改变多糖结构。具有抗原决定簇的代谢片断则可能增加免疫学法的误差。生物检定法需找到灵敏的生化指标，应用范围非常有限。因多糖自身无光学功能团、分子量在一定范围内变化等特点，无法直接用高灵敏度的紫外、荧光或质谱检测器检测，而只能用检测限在μg级的示差或蒸发光检测器检测。近年来有学者用检测限在几十ng的HPLC-柱后荧光衍生化的方法研究了硫酸皮肤素(Huang Y，WashioY，Hara M，et al.Simultaneous determination of dermatan sulfate andoversulfated dermatan sulfate in plasma by high-performance liquidchromatography with postcolumn fluorescence derivatization.AnalBiochem，1996，240227-234)和地黄多糖(郑年新，阮金秀，张永祥等。六味地黄多糖在小鼠体内的吸收。中国药理学通报，2000，16(4)403-405)的药代动力学。多糖与盐酸胍在碱性条件下反应可产生带荧光的衍生物，反应过程被认为首先是单糖残基在碱性条件下发生β-消除反应，然后再与胍相结合。硫酸皮肤素和地黄多糖均含糖醛酸残基，较易发生β-消除反应，故检测限可达20ng左右。但中性多糖直接应用文献方法进行测定时灵敏度很差。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于在现有荧光衍生化测定多糖的基础上进一步发展，提供一种可靠、稳定，检测限可达几十ng的多糖定量检测方法及系统。本专利技术公开的多糖定量检测方法是多糖柱后水解荧光衍生含量定量检测法，该方法是先将多糖经色谱柱分离后进行水解再与荧光衍生化试剂反应，通过荧光检测器对生成的荧光衍生物的测定，获得多糖的含量。本专利技术人经过大量实验发现，多糖水解后的荧光衍生物测定灵敏度大大提高，其原理主要是通过水解多糖而增加衍生反应效率，故具通用性，适合于各种类型的多糖。其检测限可达几十ng。本专利技术公开的用于多糖定量检测的系统依次包括下述部分高效液相色谱柱、水解反应器、荧光衍生化反应器、冷却管、荧光检测器和工作站或记录装置。图1为本专利技术多糖柱后水解荧光衍生含量定量检测系统示意图，其中1流动相；2流动相输送泵；3进样器；4色谱柱；5酸溶液；6酸溶液输送泵；7水解反应器；8衍生化试剂的碱溶液；9衍生化试剂碱溶液输送泵；10衍生化反应器；11冷却管；12荧光检测器；13工作站或记录装置。样品A自进样器3进样后在流动相1的带动下流过色谱柱4，在色谱柱后与酸溶液5混合，混合液进入水解反应器7中反应，混合液自反应器7中流出后与含衍生化试剂的碱溶液8混合，混合液进入衍生化反应器10中反应，混合液自反应器10中流出后，通过冷却管11冷却后由荧光检测器12检测，工作站或记录装置13采集和分析数据。在本专利技术多糖定量检测系统中，多糖首先通过色谱柱分离，然后在酸存在下进行水解反应，所述的酸选自无机酸或有机酸，包括但不限于盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸等。水解物再与荧光衍生化试剂反应生成荧光衍生物，所述荧光衍生化试剂选自含胍基、脒基或氰基的化合物，包括但不限于盐酸胍、精氨酸、脒基牛磺酸或氰基乙酰胺等。本专利技术所述的各反应器选用的材料可以是聚四氟乙烯、不锈钢等，其管径和长度可根据需要任意选择。本专利技术是通过水解多糖增加反应位点而增加衍生反应效率，故具通用性，适合于各种类型的多糖。麦冬多糖和Dextran T40经水解再荧光衍生获得的荧光强度均为不经水解直接同等条件下荧光衍生获得的荧光强度的40倍左右。其检测限可达几十ng，是HPLC-ELSD法的几十倍，方法线性关系、重现性和精密度都较好，同时由于它是在得到样品并对样品进行色谱分离后再改变结构来测定，故在专属性、应用范围和反映多糖真实性质和体内过程等方面优于同位素标记法、柱前紫外或荧光衍生法、免疫学法、生物检定法等方法。附图说明图1多糖柱后水解荧光衍生含量定量检测系统示意图其中1流动相；2流动相输送泵；3进样器；4色谱柱；5酸溶液；6酸溶液输送泵；7水解反应器；8衍生化试剂的碱溶液；9衍生化试剂碱溶液输送泵；10衍生化反应器；11冷却管；12荧光检测器；13工作站或记录装置。下面结合实施例对本方面作进一步描述。具体实施例方式实施例1 麦冬多糖的测定麦冬多糖是分子量约5000的β-D-果聚糖。1.1.装置同图1。流动相为水，流速0.4mL/min；酸溶液流速0.1mL/min；衍生化试剂的碱溶液为盐酸胍的NaOH溶液，流速0.3mL/min。反应器1由最高可加热至170℃的加热装置和0.5mm×5m聚四氟乙烯反应管组成；反应器2由最高可加热至170℃的加热装置和0.5mm×10m不锈钢反应管组成；冷却管为0.25mm×3m不锈钢管。测定波长激发波长(Ex)＝310nm，发射波长(Em)＝430nm。1.2.方法测定条件的确定1.2.1.酸溶液浓度以三氟乙酸(TFA)为代表进行考察。NaOH浓度用式(1)计算，盐酸胍浓度为50mmol/L，反应器1和2的温度均为100℃。CNaOH＝(CTFA/3)+0.5 (1)结果见表1。水解用酸浓度对高、低浓度麦冬多糖的影响相似，在0.25mol/L～2.5mol/L浓度范围内荧光强度最大，且较稳定。选用达最佳效果的最低浓度为最佳浓度，即最佳酸浓度为0.25mol/L。表1三氟乙酸浓度对柱后水解后荧光衍生法测定麦冬多糖的影响酸浓度(mol/L)低浓度样品峰面积 高浓度样品峰面积523271 2112943.5 24041 2197582.5 27372 2426831.5 26791 2402680.5 27371 2442870.25 26397 2284410.05 20905 1850330.02515095 13195303001 237671.2.2.NaOH浓度盐酸胍浓度和反应温度同“1.2.1”，固定TFA浓度为0.25mol/L，考察NaOH浓度对方法的影响。结果见表2。氢氧化钠浓度对高、低浓度麦冬多糖的影响相似，最佳浓度为0.173mol/L。因氢氧化钠浓度对反应的影响较大，而水解用酸的浓度和混合比例均会影响最终反应介质的pH值，故对反应介质pH值与荧光强度的关系作了进一步研究，结果反应介质pH值在12～12.2范围内荧光强度最大，且较稳定。表2氢氧化钠浓度对柱后水解后荧光衍生法测定麦冬多糖的影响碱浓度(mol/L)低浓度样品峰面积 高浓度样品峰面积1.08317563 1410440.88318694 1590670.68320731 1741600.58323109 1992190.48324892 2210920.383本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多糖定量检测方法，其特征在于该方法是先将多糖经色谱柱分离后进行水解再与荧光衍生化试剂反应，通过荧光检测器对生成的荧光衍生物的测定，获得多糖的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林晓，徐德生，冯怡，沈岚，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。