一种中药有效成分的检测方法技术

一种利用活性细胞与中药中有效成分的相互作用测出中药有效成分的方法，包括将中药提取液与细胞混合进行培养，同时进行空白对照，用高效色谱法分别检测中药提取液与细胞结合后与空白中药对照液，比较两者指纹图谱的改变，峰面积改变的峰，即是与活性细胞有相互作用的成分，运用ＬＣ－ＭＳ，ＮＭＲ等技术，获得与细胞有相互作用成分的结构信息，该方法快捷，准确，相对简单，成本较低，从中药中筛选有效成分的效率显著提高，并且可以作为中药质量控制的补充手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中药有效成分的检测方法，具体为利用活性细胞与中药中有效成分的相互作用检测出中药有效成分的方法。
技术介绍
传统的中药活性成分的研究，通常是采用植物化学的方法提取其中的有效部位化合物群或单体化合物，再经药理实验进行确定。中药成分复杂，一味中药就含有几十甚至数百个化合物，而一个由多种中药组成的复方，其中化学成分就更多了，再经过煎煮过程后，其中化学成分又可能产生化合或分解等新的变化。在众多的化学成分中，而有效成分往往含量低微，因此其分离分析操作烦琐，工作量大，周期长，成功率低，并且不能完全阐明中药多成分，多靶点的作用特点。生物色谱是用于考察药物对细胞膜、受体、酶等结合情况的一种较新的方法，该方法是以硅胶或凝胶为载体，其上涂敷或键合上活性细胞膜或受体、酶等制备而成色谱固定相，根据药物与细胞膜或受体、酶的相互作用的强弱不同而将不同的药物分离开来。该方法亦可用于从中药中筛选与生物膜或受体、酶等有相互作用的化学成分，但其在实际使用中存在诸多缺憾。例如1、细胞膜、受体、酶与硅胶等载体结合后其生物学特征会受到一定的影响。2.细胞膜、受体、蛋白等是从细胞上分离出来的，生物学特征可能受到一定的影响。3、该方法对色谱流动相有着严格的限制，即只能以生理缓冲液或极低浓度的有机溶剂作为流动相，否则会破坏生物膜，这样使色谱利用不同流动相而实现不同性质的化合物的分离的特点难以发挥，化合物在生物色谱上难以实现彼此的相互分离。4，生物色谱的制备程序因为增加了硅胶介质与细胞膜、受体、酶等的结合过程，过程复杂，条件严格，成本较高，如市售的蛋白柱高达上万元一个。参见汪海林等，分子生物膜色谱用于中药活性成分筛选及质量控制方法的研究，色谱，1999，17(2)123-124；赵惠如等，用细胞膜色谱筛选当归中的有效成分，中国药学杂志，2000；35(1)13-15；孔亮等，以人血清白蛋白为固定相的分子生物色谱分析几种中药活性成分的研究，高等学校化学学报，2000，21(1)36。贺浪冲等固定在硅胶表面细胞膜的酶活性及其色谱特性科学通报，1999(6)633-637。赵小娟等，淫羊藿根与叶活性成分的分析和比较，分析化学，2002 30(2)195-197。高琨等用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分中国药学杂志，2003(1)14-16。上述所有文章提供的图谱对药物的分离效果都不好，所有的流动相是用缓冲液，不能与LC-MS联用，硅胶介质价格较高。在毛希琴等，三种色谱模式联用在中药活性成分初步筛选中的应用，分析化学2003，31(8)992-995.的文献中，有川芎在模拟生物膜色谱柱、蛋白色谱柱和反相柱上的分离图谱，显而易见生物膜色谱的分离效能不理想，不如反相色谱柱。专利技术人曾研究利用生物膜与中药中有效成分的相互作用检测出中药有效成分。药物进入人体后发挥作用，主要是药物分子与细胞上的靶点即生物大分子包括酶、受体、通道等特异性的结合，进而影响细胞内第二信使分子产生生物效应，最终发挥药理作用。所以，细胞是绝大部分药物产生作用的靶标。
技术实现思路
本专利技术的要解决的问题在于研究一种快捷，准确，体现中药多成分协同作用的检测中药中与活性细胞有相互作用的化学成分的方法，尽可能地避免因细胞的生物学特征受到影响而影响到有效成分的筛选的准确性，提高有效成分的分离效果，并且在筛选有效成分的同时获得其结构信息，以便快速的从中药中寻找可能具有活性的先导化合物或化合物群。同时该方法相对简单、成本较低，并可以作为中药质量控制的补充手段。为解决上述问题，本专利技术提供如下技术方案。一种中药有效成分检测方法，包括如下步骤取待测中药，用溶剂提取，得中药提取液备用；将中药提取液与活性细胞混合，培养后，取上清液；用高效色谱法检测中药提取液的上清液。所述检测方法中，待测中药是单味中药或中药复方；提取中药的溶剂可以是水和/或有机溶剂；对含有机溶剂提取液，浓缩去除全部有机溶剂后，用缓冲液或低于3％的增溶剂溶解，制成中药提取液备用。具体提取中药的溶剂可选自水、C1-C5的低级醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它们的混合物；C1-C5的低级醇是甲醇，乙醇、正丁醇；提取中药的溶剂是中性、酸性或碱性；选用无机酸、无机碱、有机酸或有机碱中和酸性或碱性的中药提取液。按中药提取液的体积加入0.1-3％体积的增溶剂，增溶剂选自吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇、曲拉通或它们的混合物。本专利技术的检测方法中中药提取液是用水和/或乙醇提取制备的中药提取液；缓冲液是pH7.0-7.4的磷酸盐或醋酸盐缓冲液。前述检测方法特征在于活性细胞为来自人体或动物组织细胞的细胞，活性细胞是内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞；细胞培养所需要的细胞量为106以上；将中药提取液与活性细胞在模拟生理条件下的缓冲液或细胞培养液中培养，培养用的模拟生理条件的缓冲液是pH7.0-7.4的磷酸盐或醋酸盐缓冲液或含1-20％小牛血清的细胞培养液；培养后，取上清液，同时将不含细胞的中药提取液作为空白对照，分别用高效色谱法检测上清液和作为空白对照的中药提取液，比较两者指纹图谱，峰面积改变的峰，即是与活性细胞有相互作用的成分。较好的检测方法中，细胞培养所需要的细胞量为106～109；细胞培养时间为1-12小时，待中药中的有效成分与细胞结合达饱和后离心取上清液，用高效液相色谱分别检测细胞培养后的上清液与空白对照的上清液。而且，用高效色谱法检测中药提取液培养后的上清液，可与液相-质谱和/或核磁共振联用，获得与细胞有相互作用的成分的结构信息。所述检测方法，用高效色谱法检测中药提取液培养后的上清液，与液相-质谱和/或核磁共振联用，获得与细胞有相互作用成分的指纹图谱。本专利技术提供了一种快捷，准确，体现中药多成分协同作用的检测中药中与活性细胞有相互作用的化学成分的方法，所述检测包括筛选与测定，避免了因细胞的生物学特征受到影响而影响到有效成分的筛选的准确性，可与LC-MS联用，提高有效成分的分离效果，并且在筛选有效成分的同时获得其结构信息，可以快速的从中药中寻找可能具有活性的先导化合物或化合物群。同时本专利技术方法相对简单、成本较低，从中药中筛选有效成分的效率显著提高，并且可以作为中药质量控制的补充手段。中药指纹图谱是现在用于中药质量控制的一个关键技术，但现行指纹图谱存在的一个突出问题就是不能提供该中药的药理信息。例如，图1中表示的当归补血汤的红色线图谱(位置在上方)即是当归补血汤的指纹图谱，它仅仅能提供中药材所含成分的化学信息。应用本专利技术方法将当归补血汤与内皮细胞作用后再做指纹图谱，如图2中当归补血汤的蓝色线图(位置在下方)，可以看出共有5个峰的峰面积发生了明显的变化。药物与活性细胞的相互作用是药物产生药理活性的前提，在用指纹图谱进行中药质量控制时，这些有变化的峰应该是重点控制的对象，因为他们才可能是该药的活性物质基础。本专利技术方法将生物学技术与液相色谱联用，结果比生物色谱方法更加简便，结论更可靠。细胞比模拟生物膜的特异性更强。细胞膜是从细胞上分离出来的，其生物学特征可能会受到影响，本专利技术直接采用活性细胞，并且将活性细胞与药物混合后进行培养，这样与人体的作为药物靶标的细胞更加接近，因此其结果比细胞膜更加可信。如果利用与生物膜有结合的药物不能透过透析膜的特点，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中药有效成分检测方法，包括如下步骤：　　　　取待测中药，用溶剂提取，得中药提取液备用；　　　　将中药提取液与活性细胞混合，培养后，取上清液；　　　　用高效色谱法检测中药提取液的上清液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李萍，盛亮洪，李睿岩，李松林，王伟，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]