本发明专利技术提供了一种人甲状腺过氧化物酶抗体磁分离酶联免疫检测方法，其检测步骤为：加样与免疫反应，洗涤，加入二抗酶标试剂，再洗涤，加入单磷酸酚酞底物溶液，终止显色，读取吸光值。本发明专利技术的优点在于：利用了重组人甲状腺过氧化物酶抗原包被免疫磁性微珠作为固相，并采用了碱性磷酸酶作为标记酶，大大提高了检测的灵敏度和准确性。对甲状腺疾病患者和正常人血清进行甲状腺过氧化物酶抗体的定量测定，结合其他临床症状就可以判断检查者是否患有自身免疫性甲状腺疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫检测分析领域，具体涉及到一种人甲状腺过氧化物酶抗体磁分离酶联免疫检测方法。
技术介绍
大家知道，甲状腺自身免疫性疾病患者血清中通常含有甲状腺微粒体抗原，这种抗原自发现20多年来，其生物学基本性质一直没有研究清楚。随着分子生物学技术的发展，许多研究证实甲状腺微粒体抗原的主要成分是甲状腺过氧化物酶(NAOKATA YOKOYAMA等，Journal of clinical Endocrinology andMetabolism)。甲状腺过氧化物酶是一种膜整合蛋白，定位于滤泡细胞的顶端膜上，该酶以血红素为辅基，分子量约为101KD。甲状腺自身免疫疾病的传统检测通常以甲状腺微粒体抗体为主，以放射免疫和酶联免疫吸附方法为主。随着甲状腺过氧化物酶的分子生物学性质和与甲状腺微粒体抗原关系的深入研究，陆续出现了甲状腺过氧化物酶抗体的免疫学检测方法，大大提高了检测的准确性，但是依然以定性或半定量检测为主。免疫磁性微球是表面携带有活化功能基团的直径在0.1-10μm范围的高分子包被磁性颗粒。磁性颗粒具有超顺磁性，在磁场下具磁场响应性，将免疫磁性微球用于免疫检测的固相，将大大提高反应的表面积，更容易进行固液分离，使检测的灵敏度得到很大的提高。从小牛肠粘膜提取的碱性磷酸酶分子量约140KD，以碱性磷酸酶作为示踪酶的免疫检测方法，其灵敏度高于酶联免疫吸附分析检测中常用的辣根过氧化物酶，空白值(本底)也较低(吴建民，临床化学自动化免疫分析，科学出版社)。碱性磷酸酶常用的底物有对硝基苯磷酸盐(PNP)，4-甲基伞形酮磷酸盐(4-MUP)等，也可以使用单磷酸酚酞(PPM)作为底物，加入碱性终止液后显色。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有较高稳定性，灵敏度和准确性的人甲状腺过氧化物酶抗体磁分离酶联免疫检测分析方法。利用该方法，使用重组人甲状腺过氧化物酶抗原偶联磁性微珠为固相，山羊抗人免疫球蛋白G抗体连接碱性磷酸酶为二抗酶标试剂，单磷酸酚酞溶液为底物溶液，采用免疫学原理，就可以进行血清中人甲状腺过氧化物酶抗体的定量测定，其操作步骤如下1、加样与免疫反应在平底试管中加入10-30μl血清样本(预先用样本稀释缓冲液进行1∶50-100稀释)，标准品，或质量控制血清，加入60-120μl 8-14mg/ml固相磁分离试剂(表面偶联重组人甲状腺过氧化物酶抗原)，混匀后，37℃温育15-60分钟。2、洗涤将平底试管放在磁分离器上分离2分钟，然后用圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，拍击分离器以除去挂壁液体。每管中加入清洗液100-500μl，充分混匀后，将平底试管放在磁分离器上分离2分钟，然后用圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，拍击分离器以除去挂壁液体。重复两次。3、加入二抗酶标试剂在每一试管中加入碱性磷酸酶(EC3.1.3.1)连接的山羊抗人免疫球蛋白G抗体工作液30-120μl，混匀后，37℃温育15分钟。4、洗涤同(2)步骤。5、加入单磷酸酚酞底物溶液每管加入90-120μl单磷酸酚酞底物溶液，混匀后，37℃温育15-60分钟。6、终止显色每管加入300-500μl碱性终止液，并放在磁分离器上分离5分钟以上。7、读取吸光值在分光光度计上或使用磁酶免测定仪I(北京倍爱康生物技术股份有限公司生产)上读取吸光值，波长为492nm/550nm。在上述步骤中，标准品的配制为2g氯化钠，2.42三羟基氨基甲烷，5g牛血清白蛋白，0.5ml普劳可林300用1000ml纯化水溶解，用盐酸调pH至7.6，0.2μm过滤器过滤，于4℃保存，作为标准品的缓冲液。参照WHO 1STIRP 66/387标准)浓度配制标准品(标准品范围为0-1000IU/ml)，于4℃保存，用于制作标准曲线。在上述步骤中，固相磁分离试剂的制备为将直径范围0.1-10μm的磁性微球用戊二醛进行活化，室温混匀4小时后，用0.01mol/l PBS pH7.4缓冲液清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为50-100mg/ml；然后，每毫升悬液中加入重组人甲状腺过氧化物酶抗原20-100μg，于37℃混匀温育3-8小时；用等体积的0.01mol/l PBS 5％BSA pH7.4缓冲液于37℃封闭30-90分钟；最后，用0.5％BSA0.02mol/l Tris-HCl pH8.0缓冲液清洗三次，并用该溶液配制成8-14mg/ml的工作液。在上述步骤中，二抗酶标试剂的制备为(1)将山羊抗人免疫球蛋白G抗体溶于0.01mol/l PBS pH7.4溶液中，浓度5-10mg/ml；加入20mmol/l活化剂N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二巯基)丙酸二甲亚砜溶液20-30μl，室温放置30-60分钟；通过Sephadex G25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；每毫升活化的抗体溶液中加入500μl 24mg/ml二硫苏糖醇(DTT)0.01mol/l PBS pH7.4溶液，混匀后，室温放置30分钟；通过Sephadex G25柱子除去游离的二硫苏糖醇，收集蛋白峰。(2)将碱性磷酸酶溶于2mmol/l EDTA 20mmol/l Tris-HCl pH8.0溶液中，浓度5mg/ml；加入0.10mg/ml Traunt试剂(巯基活化试剂)室温放置1小时；通过Sephadex G25柱子除去游离的活化剂，收集蛋白峰。(3)将(1)和(2)溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1∶1混合，室温放置4小时，然后使用Superdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将连接物保存于4℃。(4)用1mmol/1MgCl2 20mmol/l Tris-HCl pH8.0溶液将连接物配制成0.5-2μg/ml工作液，使用0.2μm过滤器过滤。在上述步骤中，清洗液的配制组成氯化钠(NaCl)2g，磷酸二氢钠(NaH2PO4.12H2O)2.9g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.2g，氯化钾(KCl)0.2g，曲拉通X-100 0.5ml，吐温20 0.2ml，布兰尼道克斯(Bronidox-L)5g，用纯化水配成1000ml，用0.2μm过滤器过滤，于室温保存。在上述步骤中，底物溶液的配制组成乙醇胺100g，氯化钠(NaCl)2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000ml，用37％盐酸调pH至8.4，用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。在上述步骤中，终止液的配制组成氯化钠(NaCl)1g，碳酸钠(Na2CO3)15g，EDTA-Na2 10g，用纯化水配成1000ml，用0.2μm过滤器过滤，于室温保存。本专利技术的优点在于利用了重组人甲状腺过氧化物酶抗原包被免疫磁性微珠作为固相，并采用了碱性磷酸酶作为标记酶，大大提高了检测的灵敏度和准确性。对甲状腺疾病患者和正常人血清进行甲状腺过氧化物酶抗体的定量测定，结合其他临床症状(如甲状腺球蛋白抗体)就可以判断检查者是否患有自身免疫性甲状腺疾病。具体实施例方式材料与仪器1、标准品0，10，40，100，250，500IU/ml(参照WHO 1STIRP 66/387标准)各1ml。2、磁分离试剂(10mg/ml)20ml。3、二抗酶标试剂(1μg/ml)20ml。4、洗涤液1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人甲状腺过氧化物酶抗体磁分离酶联免疫检测方法，其特征在于：检测步骤为：ａ、加样与免疫反应：在平底试管中加入１０－３０μｌ血清样本标准品或质量控制血清，加入６０－１２０μｌ８－１４ｍｇ／ｍｌ固相磁分离试剂，混匀后，３７℃温育１５－ ６０分钟；ｂ、洗涤：将平底试管放在磁分离器上分离２分钟，然后用圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，拍击分离器以除去挂壁液体，每管中加入清洗液１００－５００μｌ，充分混匀后，将平底试管放在磁分离器上分离２分钟，然后用 圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，拍击分离器以除去挂壁液体；重复两次；ｃ、加入二抗酶标试剂：在每一试管中加入碱性磷酸酶ＥＣ３．１．３．１连接的山羊抗人免疫球蛋白Ｇ抗体工作液３０－１２０μｌ，混匀后，３７℃温育１５ 分钟；ｄ、洗涤：同ｂ步骤；ｅ、加入单磷酸酚酞底物溶液：每管加入９０－１２０μｌ单磷酸酚酞底物溶液，混匀后，３７℃温育１５－６０分钟；ｆ、终止显色：每管加入３００－５００μｌ碱性终止液，并放在磁分离器上分离５分钟以上； ｇ、读取吸光值：在分光光度计上或使用磁酶免测定仪Ⅰ上读取吸光值，波长为４９２ｎｍ／５５０ｎｍ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘振世，周昊，陈海生，张玉庆，杨祥良，
申请(专利权)人：北京倍爱康生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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