用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括蛋白芯片、反应液和洗涤液，其中蛋白芯片由固相载体和固定在该载体上的与ＴｏＲＣＨ相关蛋白组成，其特征在于其中的蛋白芯片的固相载体选自经硅烷化处理的载玻片或有机聚合物材料；所述的与ＴｏＲＣＨ相关蛋白包括：ＣＭＶ特异性抗原，ＨＳＶⅠ、Ⅱ型特异性抗原、ＲＶ特异性抗原和ＴＯＸ特异性抗原，各抗原点样体积为１－１００ｎｌ，点样浓度为１＊１０↑［－６］一１００ｍｇ／ｍｌ；在蛋白芯片上还点有阴性对照和一系列已知浓度的内参照ＩｇＧ，ＩｇＭ，阴性对照为兔肌球蛋白、肌动蛋白或胶原蛋白。本发明专利技术试剂盒是一种灵敏、准确、迅速的孕妇血样检测的试剂盒。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种。
技术介绍
ToRCH是四种人类致病微生物英文名称字头的组合包括弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)以及单纯疱疹病毒(HSV)I和II型。它们是四种最可能导致畸胎的传染病的病原体。巨细胞病毒属疱疹病毒群，其传染源是患者和无症状的隐性感染者。若孕妇感染单纯疱疹易引起流产、死胎，后期感染主要引起小儿头畸形、智力发育障碍，亦有报道可引起先天性心脏病、脐疝、足畸形和肝脾肿大等。单纯疱疹是由单纯疱疹病毒所致的传染性疾病，根据其抗原性质的不同分为两型即HSV I和HSV II。若孕妇感染单纯疱疹，妊娠早期可引起死胎、流产、小儿头畸形、小眼畸形、脑内钙化等神经系统畸形，其症状与巨细胞病毒相似。风疹病毒是传染性最强的致畸因子，亦是致畸作用最明显的一种病毒。风疹病毒诱发先天性畸形除白内障外，还有心脏畸形(动脉导管未闭、心房和心室间隔缺损)、耳聋、青光眼、小眼、小头、智能发育不全和牙釉质缺损等。最近发现风疹病毒还可以引起胎儿生长迟缓，心肌损害。患风疹发生先天性畸形可达40％以上。弓形虫是专一性的细胞内寄生虫，它破坏人体除红细胞以外的所有有核细胞。若孕妇感染弓形虫，还可通过胎盘感染胎儿，造成早产、死产或胎儿畸形或其它先天性疾病，尤其是造成智力低下，带来严重后果。在我国，每年出生100多万与弓形虫感染有关的畸形儿和先天性残疾儿。ToRCH患者造成孕妇流产、死胎，勉强出生后有严重的智力障碍，生活不能自理，并伴有复杂的心血管病，需要家人的长期照顾，造成极大的精神及经济负担。我国每年约有1000万个产妇，26000个ToRCH患儿出生，平均每小时就有3个。由于成人ToRCH感染的临床症状不明显，因此一般不易察觉。世界上许多发达国家已将ToRCH列为孕期常规检查项目，在优生优育方面发挥重要作用。在国内，随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，人们对优生优育的认识逐步提高，许多地区已将ToRCH检测作为孕期常规检查项目。ToRCH在临床诊断上通常检测的是针对相应病原物感染后人体内产生的IgG或IgM。检出特异性IgM说明患者为近期感染，或潜伏的病毒被激活产生复发感染；检出特异性IgG则为继往感染，已有一定的免疫水平。当患者复发感染时，IgM和IgG都会较快地上升到高滴度，其中IgG上升极其显著(一般可上升4倍以上的水平)，因此临床上若检测出高滴度的IgG，则意味着再次感染。目前ToRCH感染的实验室诊断常规采用ELISA方法，另外还有PCR、金标等方法。PCR具有灵敏度极高的特点，能直接检测病原体基因；金标法比较操作简单，适合基层单位使用；而ELISA通常检测病原的特异性抗体，灵敏度较高、特异性较强。但以上方法涉及的试剂较多，操作复杂，反应时间长。生物芯片技术是九十年代中期兴起的一项新兴生物技术，因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到众多研究者的瞩目，迅速在诸多生物学领域得到应用。生物芯片技术按检测对象分类，主要分为基因芯片和蛋白芯片两类。蛋白芯片通过固定于支持介质上的多种蛋白质构成的微阵列，直接检测特定功能物质(标志性蛋白)。与传统检测方式相比，利用蛋白芯片技术对特殊致病微生物进行检测具有以下优点1)高通量，同时可进行多人份多指标的检测，也可单独使用；2)高敏感度和特异性；3)操作快速、简便，适用于临床即时检测，只需一个半小时便能完成整个检测反应过程；4)所需样本量少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于利用蛋白芯片技术，同时对巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、风疹病毒(RV)和弓形虫(TOX)进行检测，提供一种灵敏、准确、迅速的孕妇血样检测的试剂盒。本专利技术公开的用于同时检测ToRCH指标的试剂盒由蛋白芯片、反应液、洗涤液组成。蛋白芯片由固相载体和固定在该载体上的与ToRCH相关蛋白组成。其中所述的固相载体选自经硅烷化处理的载玻片或有机聚合物材料等；所述的ToRCH相关蛋白包括CMV特异性抗原，HSV I、II型特异性抗原、RV特异性抗原和TOX特异性抗原；各抗原点样体积为1-100nl，点样浓度为1×10-6-100mg/ml。为提高检测的准确度和可靠性，本专利技术蛋白芯片中还设计了阴性对照和一系列已知浓度的内参照IgG，IgM。其中阴性对照为兔肌球蛋白(myosin)、肌动蛋白或胶原蛋白等。本专利技术试剂盒中的反应液为荧光试剂标记的抗人IgG、抗人IgM或荧光试剂标记的抗人IgG和抗人IgM的混合物。该荧光试剂可以为Fluorescein，Rhodamine，Coumarin，CY Dyes和Alexa Dyes，其中优选CY Dyes和Alexa Dyes，与其他荧光试剂相比，上述两种试剂具有更好的光稳定性，高水溶性和高荧光效率。本专利技术试剂盒中洗涤液至少含有一种下述浓度的溶液0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。本专利技术所述固相载体为经过硅烷化处理的载玻片，特别是经过氨丙基三甲氧基硅烷试剂处理的玻片；有机聚合物材料是指聚苯乙烯等。本专利技术所述的硅烷化处理的载玻片通过下述方法制得1)载玻片用铬酸洗液浸泡过夜，蒸馏水洗，浸入10--30％氨水中过夜，蒸馏水洗；2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的50--95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至3-5，室温处理，乙醇超声清洗，水超声清洗，140--180℃烘干2-24小时； 3)用2-8％戊二醛处理成醛基化；4)使用前0.01-5％SDS和清水各洗两次，空气干燥后0.01--5％NaBH4溶液还原5--30min，0.01-5％SDS洗一次，水洗一次，空气干燥后用待用。本专利技术所要解决的另一技术问题是提供上述检测试剂盒的制备方法。一、蛋白芯片的制备方法1)用稀释液将蛋白芯片上所要点制的蛋白质稀释到一定浓度；用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在固相基质上，点样密度在10-200点/cm2；HSV II型特异性抗原，RV特异性抗原，TOX特异性抗原的稀释液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20；CMV特异性抗原稀释液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-30％蔗糖；HSV I型特异性抗原和标准IgG的稀释液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01--20％聚烯吡酮(PVP)；标准IgM的稀释液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.1-1.0％Tween20，0.01-0.5％十二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒，该试剂盒包括蛋白芯片、反应液和洗涤液，其中蛋白芯片由固相载体和固定在该载体上的与ＴｏＲＣＨ相关蛋白组成，其特征在于其中的蛋白芯片的固相载体选自经硅烷化处理的载玻片或有机聚合物材料；所述的与ＴｏＲＣＨ相关蛋白包括：ＣＭＶ特异性抗原，ＨＳＶⅠ、Ⅱ型特异性抗原、ＲＶ特异性抗原和ＴＯＸ特异性抗原，各抗原点样体积为１－１００ｎｌ，点样浓度为１×１０↑［－６］－１００ｍｇ／ｍｌ；在蛋白芯片上还点有阴性对照和一系列已知浓度的内参照ＩｇＧ，ＩｇＭ，阴性对照为兔肌球蛋白、肌动蛋白或胶原蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李润生，
申请(专利权)人：上海前沿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]