用于抗-INGAP抗体的测定制造技术

使用固相测定来检测抗ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］肽的抗体，其中ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］肽是１５－氨基酸肽，它是胰岛新生相关蛋白（ＩＮＧＡＰ）的生物活性部分。可确定抗ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］肽的抗体的同种型。试剂盒也可用于检测抗－ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］抗体。可监测内源性自身抗体或者在用ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］治疗哺乳动物期间所产生的抗体。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体测定领域。具体地讲，本专利技术涉及抗施用的治疗剂的在哺乳动物中产生的抗体。
技术介绍
胰岛是在体内产生胰岛素的唯一器官。然而，它们具有有限的再生能力。这种有限的再生能力使得哺乳动物容易患有糖尿病。胰岛新生相关蛋白(INGAP，SEQ ID NO2)在刺激胰岛新生，特别是β细胞从导管细胞中再生方面起重要作用。INGAP104-118肽(IGLHDPSHGTLPNGS，SEQ ID NO1)是包含INGAP蛋白的氨基酸104-118的15-氨基酸肽，其具有生物活性，并且能够在动物模型中诱导胰岛细胞再生。包含哺乳动物INGAP104-118肽的药物组合物可用于治疗可由糖尿病导致的内分泌性胰腺机能不全。抗INGAP104-118肽的抗体可在反复施用INGAP104-118肽之后产生，或者可作为抗内源性蛋白的自身抗体产生，它们可减轻INGAP的作用或者用作糖尿病的诊断标记物。因此，本领域需要用于检测可在用INGAP104-118肽治疗后在个体中产生的抗体的方便测定。专利技术概述本专利技术的一个实施方案是检测试验样本中的抗INGAP104-118肽的抗体的方法。该方法包括将包含哺乳动物血清的试验样本与结合在固体载体上的INGAP104-118肽接触。这种接触是在足以让抗-INGAP104-118抗体与INGAP104-118肽接触的条件下进行的。将固体载体与能特异性地结合哺乳动物的所有同种型的抗体分子的检测抗体接触。测定结合在固体载体上的检测抗体。结合在固体载体上的检测抗体指示试验样本含有抗I NGAP104-118肽的抗体。本专利技术的另一个实施方案是检测试验样本中抗INGAP104-118肽的抗体，并确定所述抗体的同种型的方法。该方法包括将包含哺乳动物血清的试验样本与结合在固体载体上的INGAP104-118接触。这种接触是在足以让抗-INGAP104-118抗体与INGAP104-118肽接触的条件下进行的。将固体载体与能特异性地结合哺乳动物的一种同种型的抗体分子的同种型特异性抗体接触。测定结合在固体载体上的同种型特异性抗体。结合在固体载体上的检测抗体指示试验样本含有抗INGAP104-118肽的抗体，以及抗INGAP104-118肽的抗体是一种同种型的抗体。本专利技术的再一个实施方案是用于检测哺乳动物血清中的抗-INGAP104-118抗体的试剂盒。所述试剂盒包含INGAP104-118肽和检测抗体。本专利技术的这些和其它实施方案给本领域提供了检测能与INGAP104-118肽结合的抗体的工具和方法，这些工具和方法可用于在用INGAP104-118肽治疗期间检测个体以及用于鉴定具有INGAP自身抗体的个体。附图概述附图说明图1直接检测抗-INGAP104-118的测定的示例性示意图。将肽不可逆地包被到微量滴定孔(1)的底部后，把试验样本加到孔(2)中。如果试验样本中存在对该肽有特异性的抗体，它们就会与肽结合，并且在洗涤步骤之后保留在孔中。通过随后加到孔(3)中的标记次级抗体来检测与该肽接触的抗体。洗涤步骤将没有与抗体-肽复合物接触的标记抗体除去。通过读取孔(4)中的标记信号来确定与肽结合的抗体的存在。图2所产生的抗INGAP104-118肽的兔子抗体的特异性。将兔子抗-INGAP104-118肽在预先用INGAP104-118肽(SEQ ID NO1)、牛血清白蛋白(BSA)、INGAP151-164(Cter SEQ ID NO3)或INGAP139-152(Cseq SEQ ID NO4)包被的微量滴定孔中培养。所有孔都是用相同浓度的蛋白包被。使用与碱性磷酸酶缀合的抗兔子IgG，并且使用磷酸对硝基苯酯，在405nm光检测对硝基苯酚，来检测抗-INGAP104-118抗体。水平线指示测定的背景信号限度。图3所产生的抗INGAP104-118肽的兔子抗体的特异性。将兔子抗-INGAP104-118抗体在预先用不同浓度的INGAP104-118u肽包被的微量滴定孔中培养。使用与碱性磷酸酶缀合的抗兔子IgG，并且使用磷酸对硝基苯酯，在405nm光检测对硝基苯酚，来监测结合的兔子抗-INGAP104-118抗体的检测。EC50是150pg，并且显著不同于零的最低检测量是18pg。图4人血清对抗-INGAP104-118肽抗体的影响。(A)每个数据点代表微量滴定孔中的2-1000ng/mL抗-INGAP104-118抗体和0(◆)、5()、10()、15(X)、30(·)或50(●)％标准人血清。使用与碱性磷酸酶缀合的抗兔子IgG，并且使用磷酸对硝基苯酯，在405nm光检测对硝基苯酚，来监测结合的兔子抗-INGAP104-118抗体的检测。(B)反应是如(A)所述进行的，但是没有加入兔子抗-INGAP104-118抗体。数据点相当于0(◆)、5()、10(·)、15(+)、30(-)和50％ ()标准人血清。图5抗-INGAP104-118抗体测定样本平板布置图。(1)患者血清样本的稀释物。(2)标准人血清的稀释物。(3)兔子抗-INGAP104-118抗体标准曲线。(4)在未用INGAP104-118肽包被的孔上使用最高浓度的抗-INGAP104-118抗体制备的平板空白。专利技术详述本专利技术的发现是，可在固相测定中灵敏且特异性地检测体内产生的抗-INGAP抗体。可在不被哺乳动物血清组分干扰的情况下检测抗-INGAP104-118抗体。标准人血清不含有导致假正信号的因子，也不抑制抗-INGAP104-118抗体与INGAP104-118肽的相互作用。测定哺乳动物样本中的抗-INGAP104-118抗体可用于监测在治疗性施用INGAP104-118肽期间中和抗体的生成。中和抗体可以是内源性自身抗体或者在单次或反复施用INGAP104-118肽之后在个体中产生的抗体。可灵敏且特异性地检测抗-INGAP104-118抗体。在固相测定中，可将纯化的INGAP104-118肽固定在固体载体上。因为易于将结合的组分与未结合的组分分离，固相免疫测定是方便的。连续的免疫测定步骤，包括步骤之间的洗涤以及检测抗体的结合与指示剂反应的展开可容易地进行，而无需昂贵的自动化操作和技术。可使用任何样本，包括但不限于血液、血浆或血清。本专利技术特别涉及含有血清的试验样本。血清可得自任何哺乳动物，包括例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、狗、猫、牛、山羊、猪和人。可以在一个血清浓度或可通过将血清系列稀释而获得的多个浓度下测定试验样本。血清稀释剂可源自是试验样本来源的同一物种。也可以使用其它稀释剂例如缓冲剂和标准盐水。还可以使用能够检测到信号的最高系列稀释度来表征试验样本。例如，可将关于第一种哺乳动物的能够检测到信号的最高系列稀释度与关于第二种哺乳动物的能够检测到信号的最高系列稀释度进行比较，以获得在第一种与第二种哺乳动物中的抗体效价的相对量度。可使用任何免疫反应性形式的INGAP104-118、INGAP或其衍生物。可使用天然、合成或重组形式的INGAP肽，或者能够与抗INGAP104-118肽的抗体发生免疫反应的含有或经过修饰而含有INGAP104-118序列或部分的相关蛋白。因此，可使用INGAP104-118肽的部分或含有这样的部分和其它残本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测试验样本中的抗ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］肽的抗体的方法，所述方法包括：将得自哺乳动物的试验样本与结合在固体载体上的ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］肽接触，其中所述接触是在足以让抗－ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］抗体与所述肽结合 的条件下进行的；将所述固体载体与能够特异性地结合哺乳动物的所有同种型的抗体分子的检测抗体接触；和确定结合在所述固体载体上的检测抗体，其中结合在所述固体载体上的检测抗体指示所述试验样本含有抗ＩＮＧＡＰ↑［１０４－１１８］肽的抗 体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：AI维尼克，DA素勒费斯克维克，
申请(专利权)人：GMP内治疗学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]