检测免疫反应的方法技术

传统上，转化的永生免疫细胞系一直用作药物筛选的效应物。这种方案可能忽视重要的原则：广谱免疫调节反应的开始要求巨噬细胞，Ｂ细胞和Ｔ细胞的间接相互作用。本发明专利技术利用有生存能力的脾细胞提供检测物质的免疫反应的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测化合物的免疫反应的方法，尤其是在筛选用于治疗疾病的化合物中。
技术介绍
传统上，转化的永生免疫细胞系一直用作药物筛选的效应物。例如，巨噬细胞系(RAW 264.7)在免疫调节和抗癌药物筛选领域中是一种最常用的细胞系。然而，这种方案可能忽视重要的原则广谱免疫调节反应的开始要求巨噬细胞，B细胞和T细胞的间接相互作用。结果，具有潜力担当免疫调节药的化学物和/或药物在这些“传统的”筛选体系中会轻易地得出不能诱导癌细胞系的凋亡和/或抗癌细胞因子(例如，TNF-α)的分泌，因为它们的活化途径中缺乏一些必要组分。因此，它们不能显示出作为免疫调节药物的真正潜力。专利技术目的本专利技术的目的是解决现有技术所述的至少一种或多种问题。最低程度，本专利技术的目的是给公众提供一种有用的选择。专利技术概述本专利技术提供检测物质的免疫反应的方法，包括将所述化合物与有生存能力的脾细胞温育的步骤。优选地，有生存能力的脾细胞抽提自大鼠。优选地，所述物质与脾细胞在缓冲液中于约20-40℃，更优选约37℃下温育。另外，与有生存能力的脾细胞温育的物质通过两维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE)进行分析，优选以检测至少一种下列蛋白的产量TNF-α，IFN-γ和iNOS，hoemotic蛋白LH-2，细胞色素C氧化酶多肽IV前体，DNA聚合酶β，鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白G，T-细胞表面糖蛋白CD5前体以及α-甘露糖苷酶II。优选地，所述物质与脾细胞在缓冲液中于pH约5-9，更优选于pH约7下温育。附图简述本专利技术优选的实施方案通过实施例方式并参照附图现将加以解释，在附图中附图说明图1利用Wright-Giemsa染色(X1000)示出分离的脾细胞；图2示出Rg1对TNF-α，IFN-γ分泌和iNOS合成的影响，图2A，2B和2C分别示出Rg1处理后TNF-α，IFN-γ分泌和iNOS合成的免疫印迹；图3示出采用和没采用Rg1(5μg/ml)处理后从脾细胞中分泌TNF-α和IFN-γ的时程；图4示出通过“二位一体(Two-in-One)凝胶”比较，在Rg1存在或缺乏下，脾细胞中的差异蛋白表达。Rg1处理样品示于左边，而对照样品示于右边。4A示出pH 4-5.5的样品，而4B示出pH 5.5-7的样品；图5示出通过总结Rg1对脾细胞蛋白表达的影响，Rg1对脾细胞中蛋白表达的影响，以及涉及Rg1对脾细胞的免疫调节活性的可能的调节机理。优选实施方案的详述本专利技术参照附图通过实施例方式在以下段落中加以描述。本专利技术的目的，特征和方面在下文中公开，或者从下文中显而易见。本领域普通技术人员应理解，下文仅是对示例性实施方案的描述，并非旨在限制本专利技术的范围，更宽的范围体现在代表性解释中。在本专利技术中，与传统利用细胞系的方法相反，脾细胞原始培养物用于药物筛选中。这种脾细胞培养物含有全部3种对起始广谱免疫反应所必需的免疫细胞(约30％B淋巴细胞，60％CD3+T淋巴细胞和5％巨噬细胞)。这类脾细胞可抽提自任何适于药物筛选的哺乳动物，例如大鼠，狗，猫，小鼠，豚鼠，牛，鹿，猴子等。为了实施药物筛选功能，脾细胞必须是有生存能力的。术语“有生存能力”在此表示脾细胞仍是活的，对此现有技术能够操作。这种有生存能力的细胞在细胞和0.4％w/v台盼蓝溶液1∶1的混合物中不会被台盼蓝染色。有生存能力的脾细胞可采用已知方法从动物中去除，合适的实施例将在下文中进行描述。非生存能力的细胞在筛选平台上不可用作效应物，因为它们不能被药物候选物刺激，和/或彼此有效相互作用。有生存能力的脾细胞通常可在动物细胞培养工作所常用的大多数培养基中令人满意地加以培育。然而，脾细胞不可经受极端温度范围(即低于20℃和高于40℃)。有生存能力的脾细胞的最适温度为37℃。此外，如果培养基处于极端pH(即高于pH 9和低于pH 5)下，脾细胞的生存力也将下降。待检测的化合物一般以溶液的形式存在，然后通过多种方法将其施用给有生存能力的脾细胞。例如，化合物(没有内毒素污染)可被直接添加到有生存能力的脾细胞上。这当然会随待检测化合物的不同而不同，但是将化合物添加给脾细胞不是本专利技术的主题。在检测人参Rg1的免疫反应中采用有生存能力的脾细胞将在下文详细描述。实施例高度纯化的Rg1为人参中一种主要的皂角苷，已经显示可抑制癌细胞的生长。其刺激DNA，蛋白和脂类在动物组织中的生化合成。Rg1还显示担当免疫调节剂，使得内皮细胞中一氧化氮产量在Rg1诱导后增加，T辅助细胞活性，细胞因子IL-1以及自然杀伤细胞的产量增加。其他属性包括选择性增强淋巴细胞的增殖和IL-2的产生。假设人参苷(ginsenoside)抗致癌效应可能与或通过胱冬肽酶(caspase)3和/或由活性氧起始的凋亡效应相关。尽管对人参效应的研究历史悠久，但其作用的分子机理大部分仍知之甚少。材料和方法动物周龄8-10、体重200g的雄性Sprague Dawley大鼠由香港理工大学应用生物和化学技术系动物中心(the animal holding center of theDepartment of Applied Biology and Chemical Technology，The HongKong Polytechnic University)提供。所有研究都是根据最新公布的对实验室动物护理和使用的NIH指南(the NIH Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)中所述的原理和程序进行的。动物伦理学批文已从香港理工大学动物伦理学分委员会获得。制备大鼠脾细胞将大鼠在醚深度麻醉下放置，并经腹部大动脉放血。通过无菌技术移出脾脏，接着在10ml含有1000U/ml青霉素-链霉素(PS)(Gibco，USA)的RPMI-1640(Gibco，USA)培养基中洗涤两次。把脾脏切成小块后，在塑料注射器中用柱塞上下抽吸。制备单个细胞悬浮液，并放置在含有1000U/ml PS和5％柠檬酸葡萄糖的同样培养基中。然后通过梯度离心将单细胞悬浮液分层到Ficoll-Pague Plus梯度(Amersham Bioscience，H.K.Ltd.)上而分离脾细胞，室温下以400g离心35分钟。收集含脾细胞的组分。室温下加入4倍体积的冰冷氯化铵溶液(pH 7.4)而裂解红细胞5分钟，将脾细胞在普通培养基中洗涤两次。淋巴细胞用Wright-Giema着色剂染色后，再在光学显微镜下检查。台盼蓝染色后，经光学显微镜检查细胞生存力和数目。将脾细胞(1×106)培养在含有1000U/ml PS、补充有2g/L碳酸钠的完全RPMI-1640培养基上。24小时温育后，使细胞重悬浮在含有10％FCS(Gibco，USA)的同样培养基上，并进行多种处理。用Rg1刺激脾细胞将Rg1(常用剂量5μg/ml)加入到位于37℃、5％CO2培养箱内6孔平底板(Nunc Maxisorp，USA)上脾细胞的PBS缓冲液中。在不同时间点(12-72小时)从温育混合物中采集条件培养基的样品。这些样品储存在-80℃备用。样品保存不超过两个月。此外，在Rg1处理的脾细胞的样品(间隔12和24小时)中使用2-DE分析也进行全蛋白的表达。与PBS温育24小时的细胞用作对照。West本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测物质对生物体的工作机理的方法，包括将该化合物与有生存能力的脾细胞温育的步骤。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：卢俊立，黄文秀，王渊渊，
申请(专利权)人：香港理工大学，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]