通过毛细管电泳法分离蛋白质的改良方法以及用于毛细管电泳法的缓冲剂组合物技术

本发明专利技术涉及一种在碱性ｐＨ下用于分析含有蛋白质成分的样品的游离溶液毛细管电泳法，该蛋白质成分包括一种或多种脂蛋白成分，其特征在于包括至少一个步骤，在该步骤中样品被引入含有分析缓冲剂的毛细管中，所述分析缓冲剂进一步含有至少一种阴离子表面活性剂类型的添加剂，该添加剂能够与脂蛋白成分发生疏水作用，并能够调节电泳迁移率。该方法还涉及一种用于毛细管电泳法的组合物，以及分析蛋白质成分的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种在样品中存在脂蛋白的条件下，通过毛细管电泳法分离蛋白质和肽的方法，同时涉及用于所述分离的包括添加剂的缓冲剂组合物。
技术介绍
分析生物液体，如血清中的蛋白质含量以用于分析目的，特别是用于诊断目的是公知的，通常通过电泳法来分离蛋白质，该方法中既可使用凝胶电泳又可使用毛细管电泳法。毛细管电泳法的一个优势在于仅需分析极少量生物液体。此外，只要可以使用高电压，则使用该技术的分离操作会非常快速，而且在分离过程中不会对样品过度加热。为分离血清蛋白，通常在碱性缓冲剂存在下使用毛细管电泳法。通常，所得到的蛋白质剖析图中含有5或6个部分，其对应于蛋白质成分，即白蛋白成分、α1-和α2-成分，β-球蛋白成分，β1-和β2-成分，以及γ-球蛋白成分。这些成分中的每个成分都包括一种或多种血清蛋白。可使用毛细管电泳法和分析缓冲剂，如美国专利US Re36011和欧洲专利EP-A-0518475、EP-A-1229325或EP-A-1258724中所描述的那些技术来实现这种分离。然而，血清蛋白的分离有时并不能令人满意。实际上，术语“蛋白质成分”此处并不仅仅意味着蛋白质成分，即α1-；α2-；β-或β1-和β2-；和γ-球蛋白成分，同时还意味着脂蛋白成分，主要是α-脂蛋白、β-脂蛋白以及前-β-脂蛋白，对于“高密度脂蛋白”、“低密度脂蛋白”和“极低密度脂蛋白”，其还被称为HDL，LDL和VLDL，即剖析图有时是不精确的，这主要是由于那些脂蛋白，主要为β-脂蛋白和前-β-脂蛋白出现在α1-和α2-球蛋白以及β1-球蛋白所对应的剖析图区内。
技术实现思路
申请人现已证明，使用阴离子表面活性剂作为分析缓冲剂中的添加剂可改善分离，特别是能够使电泳剖析图中的α1-和α2-以及β1-球蛋白区域更纯。所述添加剂选自阴离子表面活性剂，其能够与一种或多种脂蛋白成分，特别是脂蛋白疏水残基产生疏水作用。其可向脂蛋白成分提供一个或多个负电荷。其可使电泳迁移率相对于其它蛋白质成分的电泳迁移率有所改变，特别是有所降低。在根据本专利技术而使用的低浓度的所述添加剂下(其中，浓度低是相对于在其它应用中所用的添加剂浓度而言)，正如在实施例中显而易见的，在毛细管电泳法中得到的剖析图可以为除去肩峰的非常纯的峰，特别是对于α1和α2成分而言。这对于解释高血脂血清的剖析图是非常有用的，特别地，对正常血脂样品的分析也同样有用。因此，本专利技术涉及一种在碱性pH下的游离溶液毛细管电泳法，该方法用于分析含有蛋白质成分的样品，该蛋白质成分包括脂蛋白成分，在该方法中，样品被引入到含有分析缓冲剂的毛细管中，所述分析缓冲剂还包括至少一种能够与一种(或多种)脂蛋白成分发生疏水作用的阴离子表面活性剂型添加剂。所述添加剂能够向所述脂蛋白成分提供一个或多个负电荷，因此可使电泳迁移率相对于其它非脂类蛋白质成分的电泳迁移率有所改变。所述步骤之后通常还要通过迁移来分离蛋白质成分，并检测各成分。本专利技术还涉及一种通过电泳法在分析缓冲剂中分离样品的蛋白质成分的方法，该样品至少包括白蛋白和α1-、α2-和β1-球蛋白成分以及脂蛋白，其中分析缓冲剂还包括至少一种能够与脂蛋白发生疏水作用的阴离子表面活性剂型添加剂。本专利技术还涉及一种在碱性pH下，通过游离溶液毛细管电泳法从包括脂蛋白的液体样品中电泳分离蛋白质成分的方法，在该方法中，使包括所述成分的样品通过含有分析缓冲剂的毛细管，该分析缓冲液进一步含有能够与脂蛋白发生特定作用的添加剂；该添加剂可为阴离子表面活性剂，其包括疏水部分，如C10-C20的烷基链，还包括阴离子部分，其在pH大于9时供给强负电荷。阴离子表面活性剂类型的添加剂以低浓度用于缓冲剂中，从而其与白蛋白或其它非脂类的蛋白质成分的相互作用很弱，并特别集中于脂蛋白上，此处称为“脂蛋白-特异性”。对于此脂蛋白-特异性的相互作用，优选以低浓度使用阴离子型表面活性剂添加剂。对于每一种阴离子表面活性剂，所述浓度部分取决于其对脂蛋白的亲和性，部分取决于其对白蛋白的亲和性或对其它非脂类蛋白质成分的亲和性。因此每一种表面活性剂的最佳浓度都不同。其在缓冲剂中可为小于1mM的数量级，例如为0.001mM-0.2mM的数量级，优选大于0.01mM并小于0.1mM，例如在0.01mM-0.09mM的范围内。申请人已证明，特别是对SDS而言，大约0.05mM的浓度无法促成脂蛋白成分的充分迁移，而当浓度大于0.2mM时，剖析图就会变形(当浓度为0.25mM时，β2部分缩小，α1部分变形，当浓度为0.5mM时，所得的剖析图甚至会完全变形)。因此，在本专利技术毛细管电泳法的分析缓冲剂中用作添加剂，且能够与脂蛋白发生特定疏水作用的化合物可为阴离子表面活性剂，如用在MECC(胶束动电毛细管色谱)中的那些物质，但所用浓度基本上低于临界胶束浓度。在本专利技术中，将所述化合物用于如上所述的游离溶液CE中，并且脂蛋白通过所述脂蛋白的疏水残基与所述化合物的疏水部分之间的疏水作用而带有负电荷，从而导致与其它蛋白质相比，所述脂蛋白的迁移减慢。一个结果就是改善了α1、α2和β1成分的分离，使脂蛋白迁移到其通常迁至的区域之外，即α1、α2和β1区。其使用浓度低于EP-A-1229325中所述的浓度。此外，本专利技术涉及用于毛细管电泳法的电解质组合物，其包括，在可接受的载体中的至少一种缓冲剂和如上所述的阴离子表面活性剂类添加剂，其能够使脂蛋白迁移到其通常迁至的区域之外，特别是在成分α1、α2和β1的区域之外。如实施例中所示，使用本专利技术的添加剂，通过使脂蛋白迁移到通常区域之外可显著改善α1、α2和β1成分的分离。因此，与使用常用缓冲剂所进行的分析相比，其可改善血清蛋白定量分析的速度和准确度。所述添加剂对富含β-脂蛋白和前-β-脂蛋白的生物样品的分析具有特殊的优势。最后，本专利技术涉及用于分析生物样品的蛋白质成分的试剂盒，其包括至少一种分析缓冲剂和阴离于表面活性剂类型的添加剂，该添加剂能够使脂蛋白迁移到它们通常迁至的区域之外，特别是迁移至α1、α2和β1成分的区域之外，和/或包括疏水部分，例如C10-C20的烷基链，以及在pH大于9时提供强负电荷的阴离子部分，和/或一种或多种毛细管冲洗液，和/或稀释部分，和/或一种或多种用于被分析的样品的稀释剂。在该试剂盒中，缓冲剂和添加剂以及稀释剂可分别存储以备临时混合，或可混合存储。所述试剂盒任选包括进行分析的操作说明。本专利技术进一步的特征和优势将通过下列详细描述和实施例以及附图而得以明确。附图简述附图说明图1表示根据EP-A-1229325，使用缓冲剂通过毛细管电泳法分析得到的人体血清的电泳图谱。图2表示使用进一步包括本专利技术的阴离子表面活性剂添加剂的相同缓冲剂，通过毛细管电泳法分析得到的相同血清的电泳图谱。图3A、3B、3C和3D显示通过EC法得到的相同正常血脂血清的电泳图谱，该方法中使用相同的缓冲剂，并向其中分别加入0；0.05；0.07和0.25mM的SDS。图4A、4B、4C和4D显示通过EC法得到的相同高血脂血清的电泳图谱，该方法中使用相同的缓冲剂，并向其中分别加入0；0.05；0.07和0.25mM的SDS。毛细管电泳法(CE)的操作条件是本领域公知的。通常包括使用清洗剂清洗毛细管，用分析缓冲剂清洗，任选一次或多次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种碱性ｐＨ下用于样品分析的游离溶液毛细管电泳法，该样品包括含有一种或多种脂蛋白成分的蛋白质成分，其特征在于该方法包括至少一个步骤，该步骤中：样品被引入到含有分析缓冲剂的毛细管中，所述分析缓冲剂进一步包括至少一种阴离子表面活性剂类型的添加剂，其能够与脂蛋白成分发生疏水作用，并能够使电泳迁移率相对于其它蛋白质成分的电泳迁移率有所改变，缓冲剂中添加剂的浓度在０．００１ｍＭ－０．２ｍＭ的范围内。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：F罗伯特，D西蒙尼，
申请(专利权)人：莎碧亚公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]