本发明专利技术提供了一种用于毛细管电泳分离ＤＮＡ片段的低ｐＨ筛分溶液体系。其基体缓冲溶液的ｐＨ值在６．５～７．５左右，优选为７．０左右。该筛分体系可用于毛细管电泳在紫外检测条件下分离相差一个碱基的ＤＮＡ片段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种用于毛细管电泳分离DNA片段的低pH筛分溶液体系。其特征在于基体缓冲溶液的pH值在7.0左右。该筛分体系可用于毛细管电泳在紫外检测条件下分离相差一个碱基的DNA片段。
技术介绍
毛细管无胶筛分电泳的DNA分析在分子生物学基础研究中有重要的应用价值。其技术关键在于使用具有高分辨率的筛分介质。目前用于毛细管无胶电泳的高分子筛分介质是水溶性高分子溶液。目前公开报道的DNA分离介质对DNA片段的分离都是在pH值较高的TBE(Tris-borate-EDTA，即89mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，89mmol/L硼酸(boric acid)，2mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，pH＝8.3)，TTE(Tris-TAPS-EDTA，即50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，50mmol/L TAPS(N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propanesulfonic acid)，2.0mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，pH＝8.2)，TAPS-NaOH(100mmol/Lol/L N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propanesulfonicacid，用NaOH调pH值到8.0)等缓冲液中进行的，而且采用的是荧光试剂和激光诱导荧光检测手段的条件下获得的。用于紫外检测条件则分离效果很差。较高pH值的缓冲溶液还有可能使如丙烯酰胺类的DNA筛分介质发生水解，从而影响分离效果。一般使用的荧光试剂价格昂贵，毒性大，如溴化乙锭(EtBr)。激光诱导荧光检测器的价格又使其不易推广。而在紫外检测条件下，毛细管电泳单碱基分离DNA片段还比较困难。关于聚丙烯酰胺(LPA)、聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以及它们的混合溶液体系作为DNA分离介质的情况已有诸多报道。1990年，已有聚丙烯酰胺(LPA)作为DNA分离介质的报道。多年来的研究结果显示，聚丙烯酰胺(LPA)的黏度大，操作不便，不能在空柱中使用，在碱性条件下容易水解，等等。关于聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)作为DNA分离介质，文献(MadabhushiR S，Electrophoresis，1998，19224-230)认为其粘度小，具有动态涂层能力分离能力较强。用TAPS-NaOH(pH8.0)缓冲溶液稀释的6.5％PDMA(Mw98,000)用作四色荧光测序介质在42℃时，空柱条件下，其单碱基分辨率可达600碱基左右，但是其中还是有一些没有分开的片段。关于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为DNA分离介质，文献(Gao Q F，Yeung ES，Anal.Chem.，1998，701382-1388；Song J M，Yeung E S，Electrophoresis，2001，22748-754)报道，其水溶性好，粘度小，有自动涂层能力，单色测序时，用TBE缓冲溶液稀释的7％商品化的PVP(Mw1,000,000)能分离350bp的DNA片段。而在四色测序中，发现染料标记的DNA片段的迁移率要比普通条件下更大，需加入10M尿素才能减少这种迁移差异。但是这种特殊条件下使用的含有极高浓度尿素的介质溶液并不易于常规使用。文献(Song L，Liu T，Liang D，et al，Electrophoresis，2001，223688-3698)提供的一种新的DNA分离介质，即聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮的互穿网络(interpenetrating networks of polyacrylamide and polyvinylpyrrlidone，LPA/PVP)体系。这种体系的粘度小，具有动态涂层能力，分离效率高，分离的重现性好。用TBE缓冲溶液稀释的2％PVP(Mw1,000,000)和1％LPA(Mw400，000)的混合物溶液可以将DNA标准样品pBR322/HaeIII中的22个片段很好地分开，而且123/124bp达到了单碱基分离。但是其中使用了荧光试剂溴化乙锭(EtBr)，它具有很强的基因透变性，对人体和环境都有很大的毒性。文献(Wang Y.，Hao J.，Liang D.，et al，Electrophoresis.，2002，231460-1466)也提供了一种新的DNA分离介质，聚N，N-二甲基取代聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮的互穿网络(interpenetrating networks of(poly(N，N-dimethylacrylamide)and polyvinylpyrrlidone)。在以TBE缓冲溶液为背景电解质的PVP溶液中聚合N，N-二甲基取代丙烯酰胺，得到的高分子混合溶液不经纯化，直接用于dsDNA的分离。在优化条件下，DNA标准样品pBR322/HaeIIIDNA中的22个片段在15分钟内成功分离，并且123/124bp的分离度达到了1.0(激光诱导荧光检测)。但是同样也使用了荧光试剂溴化乙锭(EtBr)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于毛细管电泳分离DNA片段的低pH(pH7.0左右)筛分溶液体系，这种分离体系在紫外检测条件下就可以达到对DNA片段的单碱基分辨。本专利技术提供了一种可用于DNA分离的筛分溶液体系，该筛分溶液体系的pH为6.5-7.5之间，优选pH值为7.0。该筛分溶液体系由筛分介质和基体缓冲溶液组成。优选的基体缓冲溶液可以为NaH2PO4-Na2HPO4磷酸盐溶液，KH2PO4-K2HPO4磷酸盐溶液，(NH4)H2PO4-(NH4)2HPO4磷酸盐溶液，N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)-NaOH缓冲溶液，等等。优选缓冲液摩尔浓度在5-50mmol/L之间，进一步优选20mmol/L。进一步优选的基体缓冲溶液为NaH2PO4-Na2HPO4磷酸盐溶液，其磷酸盐浓度优选为20mmol/L，pH值为7.0。优选的NaH2PO4是至少是分析纯的。优选的Na2HPO4的至少是分析纯的。所述的筛分介质为水溶性高分子，优选的水溶性高分子介质可以是LPA，PDMA，LPA/PVP，PDMA/PVP。优选的DMA单体是购于日本东京工业化成株式会社。其优选质量浓度范围在1～20％(质量百分比)，进一步优选在1～10％，最优选是6％。优选的PVP系进口分装(购于中国医药(集团)上海化学试剂公司)。其优选质量浓度范围在1～20％(质量百分比)，进一步优选在1～10％，最优选是6％。PVP的K值优选为10～110，更优选在20～50，最优选为30。预定质量的DMA单体与预定质量的PVP之比在1∶1～6∶1之间。优选在1∶1～3∶1。最优选为1∶1。优选的AM单体是购于日本东京工业化成株式会社。其优选质量浓度范围在1～20％(质量百分比)，进一步优选在1～10％，最优选是6％。上述高分子介质的制备可以采用水溶液中的自由基聚合法。例如，先将预定质量的PVP(K值为30)粉末溶解在预定体积的基体缓冲液磷酸盐溶液中，然后加入至少分析纯的预定质量的DMA单体。混匀，除氧，在惰性气体氛围下加入引发剂。该反应可以在室温，常压下进行，两个小时内聚合反应可以完成本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于毛细管电泳分离ＤＮＡ片段的筛分溶液体系，其特征是该筛分溶液体系的ｐＨ为６．５－７．５之间。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许旭，王前，戴立信，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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