内源组成激活G蛋白偶联孤独受体制造技术

本发明专利技术公开了直接鉴定候选化合物的技术，该化合物作为对内源组成激活的Ｇ蛋白偶联孤独受体的激动剂、部分激动剂和／或最适合的逆向激动剂。这种直接鉴定的化合物最适合应用于药物中。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利文件公开的专利技术涉及跨膜受体，尤其涉及内源配体未知的内源组成激活的G蛋白偶联受体以及使用这种受体对作为这种受体的激动剂、部分激动剂和/或最适合的逆向激动剂的候选化合物进行直接鉴定筛选的方法。
技术介绍
A.G蛋白偶联受体G蛋白偶联受体具有普通结构图型。这类受体具有7个α螺旋型疏水氨基酸序列7个，每个序列由22至24个疏水氨基酸构成，每个螺旋都横跨细胞膜。由氨基酸链把这种横跨膜螺旋连接起来，这种氨基酸链在膜的胞外侧且在第4和第5跨膜螺旋之间有一较大的环。另一较大的环基本由亲水氨基酸组成，在膜的细胞内侧连接第5和第6横跨膜螺旋。该受体的羰基末端位于细胞内而氨基末端在细胞外空间中。目前认为连接着第5和第6螺旋的大环及羰基末端与G蛋白相互配合。现已鉴定Gq、Gs、Gi、Go是G蛋白。G蛋白偶联受体的通式如图1所示。在生理条件下，细胞膜中G蛋白偶联受体处于“非活性”和“活性”两种不同状态或形态的平衡中。如图2所示，非激活态受体是不能连接到胞内传导通道上来产生生物反应的。受体形态变为激活态才能连接到胞内传导通道并产生生物反应。用内源配体或外源激动剂配体可以把受体稳定在激活态。最近发现用受体而不用配体也能稳定激活态，包括修饰受体的氨基酸序列，但并不局限于此。这类方法是通过对配体结合受体产生的效应进行刺激来有效地稳定受体的活性状态的。把这种利用孤立配体的方法产生的稳态活性称为“组成受体活性”。把内源配体未知或未鉴定的受体都称为“孤独受体”。B.传统化合物筛选一般来说，使用孤独受体来筛选鉴定对联与这类受体相关生物反应进行调节的化合物是已不可能的。这是因为传统“教条”认为筛选中被选择的化合物是在受体的配体已知情况下与受体竟争性结合的化合物，即化合物干涉或阻碍自然配体与受体的结合。根据定义，这种方式不适用于孤独受体。这种现有技术以及坚持这种教条方式指导的治疗学研究主要认为除非且必须发现受体的自然配体才能使用孤独受体。而孤独受体的内源配体研究会花费几年且成本达几百万美元。进一步来说，在人类基因组中估计有2000个G蛋白偶联受体，其中大部分是孤独受体，这种传统教条极力反对对这些受体进行治疗学研究的创新方式。C.孤独受体实例GPR3，GPR4，GPR6，GPR12，GPR21，GHSR，OGR1和ALO22171 GPR3是内源配体未知的具有330个氨基酸的G蛋白偶联受体(Marchese，A等(1994)Genomics 23609；另见Iismaa，T.P.等(1994)Genomics 24391；参见图1描述的核酸和氨基酸序列)。GPR3是内源型组成激活的(Eggerick，D等(1995)Biochem.J.389837)。GPR12是GPR3的一种同源物，具有334个氨基酸，其内源配体是未知的(Song，Z.-H.，(1995)Genomics 28347；参见图1描述的氨基酸序列)。GPR6是GPR3的一种同源物，具有362个氨基酸，其内源配体是未知的(Song，Z.-H.，(1995)见上述图1描述的氨基酸序列)。GPR6转录主要在人类脑壳中，在前额皮层、海马及下丘脑中很少(Heiber，M等，DNA and CELL Biology(1995)14(1)25，参见图1描述的GPR6的核酸和氨基酸序列)。GPR4也已被证实为一种孤独GPCR(Heiber，M等，DNA and CELL Biology 25(1995))。OGR1是一种孤独GPCR，报道为GPR4的高度同系物(Xu，Y.和Casey，G.，35 Genomics397(1996)。GPR21是一种内源配体未知的具有349个氨基酸的G蛋白偶联受体(参见基因文库附加号为#U66580的核酸推导出的氨基酸序列)。GPR21被报道是位于染色体9q33上的(O，Dowd B等，187Gene75(1997)。ALO22171是一种位于染色体1q24上的来自克隆384F21的人类DNA序列。ALO22171已被证实具有一个编码361个氨基酸蛋白(参见基因文库附加号ALO22171)的开读框架1086bp。ALO22171中68％与GPR21相同(参见图5B)。GHSK也被证实为一种孤独GPCR(Howard，A.D.等，273 Science 974(1996))。技术方案在此公开的方法是对内源组成激活的G蛋白偶联孤独受体(GPCRc)相对应的候选化合物进行筛选的方法，用于对作为这种受体的激动剂、逆向激动剂或部分激动剂的候选化合物进行直接鉴定。为了达到这种筛选目的，提出使用内源组成激活的孤独GPCRG蛋白-融合蛋白。附图说明图1表示一种G蛋白偶联受体的大体结构，编号指跨膜螺旋、胞内环和胞外环。图2图示活性和非活性两种状态，为典型的G蛋白偶联受体和与第二信息传导通道的激活态连接；图3用计算机显示的“点斑”表示通过一种人体组织的孤独受体GPR4的分布(参见附录A坐标编码)；图4是表示由带有孤独受体GPR3的受感染细胞293T制备的膜比仅用对照载体转染的膜加强了GTPγS结合，膜蛋白为75μg/孔，GTPγS的放射同位素标记浓度稳定保持为1.2nM，GDP浓度稳定保持为1μm，在Wallac闪烁记录仪中的96孔格式上进行评价；图5A表示孤独受体GPR3、GPR6和GPR12的氨基酸链，图5B表示孤独受体GPR21和ALO22171的氨基酸链(共同序列#1表示配合的残基)；图6A是利用在VIP细胞中从CRE受驱动报告系统诱导β-半乳糖酶表达的加强能力，表示证实了孤独受体GPR3、GPR6和GPR12为组成激活的示意图，图6B和图6C是分别利用在293和293T细胞中从CRE受驱动报告系统诱导荧光素酶基因表达的加强能力，表示证实了孤独受体GPR21和ALO22171为组成激活的示意图；图7A、图7B和图7C表示采用RT-PCR确认的几种正常人类组织剖面中孤独受体GPR3(A)、GPR6(B)和GPR12(C)表达的相对分布，缩写Ocx＝枕骨皮层；Hypoth＝下丘脑；Tex＝颞部皮层；Fex＝额部皮层。图8A和图8B表示采用RT-PCR确认的在正常人(A)和癫痫患者(B)脑组织中表达的GPR3受体；图9A是使用GPR6探针进行原位杂交(正常鼠)结果的自动射线照片；图9B是鼠脑相应区域的参考图；图10A是自动射线照相证实GPR6探针定位杂交(Zucker鼠-廋型)结果的复印图；图10B是使用GPR6探针进行定位杂交(Zucker鼠-肥胖型)结果的自动射线照片；图10C是鼠脑相应区域的参考图；图11A-F是相使用GPR12探针定位杂交(正常鼠)结果的自动射线照片；图12是使用GPR6探针(12A)和食欲素受体探针(12B)进行原位杂交(正常鼠)结果及证实两个受体(12C和12D)同位的重叠部自动射线照片；图13是使用GPR6探针(13A)和黑皮质素-3受体探针(13B)进行原位杂交(正常鼠)结果及证实两个受体(13C和13D)同位的重叠部自动射线照片；图14提供了同位实验结果，证明了GPR6和AGRP在弓体内的共同位置上，箭头表示注意弓体内特异性细胞以及环绕该细胞的环，“点”是放射性同位素标记的GPR6，其下部较黑的阴影是AGRP。图15提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对候选化合物进行直接鉴定的方法，该化合物是作为内源组成激活Ｇ蛋白偶联孤独受体的逆向激动剂、部分激动剂和激动剂被选择的，包括步骤：（ａ）把候选化合物与哺乳动物细胞表达的ＧＰＣＲ融合蛋白接触，所述的ＧＰＣＲ融合蛋白由内源组成激活Ｇ蛋白偶联孤独受体和Ｇ蛋白构成；（ｂ）通过测定该化合物对所述被接触受体的作用来确定是否所述的化合物是所述受体的逆向激动剂、部分激动剂或激动剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：多米尼克P比汉，德里克T查默斯，廖王蓁，林伊玲，凯文洛斯，陈若平，
申请(专利权)人：阿瑞那制药公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]