基于细胞的高通量检测法、其使用方法和试剂盒技术

在本发明专利技术中，细胞被放置于多孔板内并生长其中。当进行检测时，利用重力洗涤掉任何未结合的配体，而不是利用真空或离心。然后检查细胞，以检测出结合的配体。为了进行洗涤步骤，板被放置于具有与过滤板的孔相对准的开放孔的载体板内，或者可以使用与过滤板底部相附着的虹吸装置或排水管。加入足够量的洗涤液，以容许通过重力的作用发生过滤。细胞被保留在孔内的效率是其他快速方法的４倍。

【技术实现步骤摘要】
基于细胞的高通量检测法、其使用方法和试剂盒 相关申请的交叉引用本申请要求2007年1月31日提交的美国临时申请No. 60/898,571 的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本申请。本专利技术涉及基于细胞的高通量检测法、使用这种检测法的方法以及 这种检测法的试剂盒。更具体地，本专利技术涉及用于高通量细胞检测法如 免疫测定法中的基于重力的洗涤/过滤步骤。
技术介绍
使用各种方法来检测细胞和另一种实体(通常是药物或药物候选 物、毒素、环境污染物等)之间的相互作用在本领域是公知的。可以广 泛地获得多种这样的基于细胞的检测形式。这些检测法被用于检测测试 化合物对细胞的一种或多种标记物分子(一般是蛋白质)的表达的作 用。基于细胞的检测法 一 般测定分化性应答(differentiatWe response)，其需要针对于细胞的细胞壁上或细胞内的分化特异性标记 物分子例如蛋白的免疫测定法。 一般而言，至少要加入结合标记物分子 结合的第一配体(第一抗体或其他实体)，第一配体本身或者第二配体 (例如具有可检测标记物的第二抗体)通常能够被流式细胞术、比色法 或放射测定法所检测到。免疫测定法要求在检测步骤之前去除未结合配体。通常通过离心洗 涤步骤可以实现这个要求。降低加入一种或多种配体之后的液体水平， 并将洗涤缓冲液加入到溶液内。然后进行洗涤，去除上清液，将细胞留在少量液体内。常常重复洗涤步骤3到8次，以便保证能基本上去除未结合物质。这是一个费时的过程，并受限于个人在任何给定时间内所能处理的 试管数目。兼容所有操作的自动化也不是一件容易的事情。另外，废弃 的量以及其所来源的部位都有所不同，并造成了细胞的丢失，可能是因 为倾倒或者是因为液体缺少(如果倒的太多)所造成的细胞应激或死 亡。同样，必须保持足够多的洗涤次数，以保证去除掉足够量的背景试 剂，使得可以得到准确的测定值。US 2001/0055776 Al提出了用具有多孔过滤板的真空装置提供更高 通量形式的用途。低真空是难以控制的，每个孔对低真空的应答都有所 不同。这使得在一些已变干的孔和其他仍保持太多液体而导致假阳性信 号的孔之间出现了不一致的结果。更重要的是，细胞回收率是非常低 的，虽然在一些情况中可能容许利用剩余的少数细胞进行检测。缺乏高通量的、高细胞活力/保留率的检测法是实现蛋白质组学用于 药物开发的全部潜能的主要瓶颈。本专利技术提供了这样一种解决方案。
技术实现思路
在本专利技术中，细胞被放置于多孔板内并在此生长。当进行检测时， 可以利用重力洗涤掉任何未结合的配体，而不是利用真空装置或离心。 然后检査细胞以检测出结合的配体。本专利技术的一个目的是提供用重力流洗涤多孔过滤板中所用细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供用重力流洗涤具有聚碳酸酯滤膜的多孔 过滤板中所用细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供用重力流洗涤具有亲水性聚碳酸酯滤膜 的多孔过滤板中所用细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供用重力流洗涤具有孔径约为3微米的亲 水性聚碳酸酯滤膜的多孔过滤板所用细胞的方法。本专利技术的一个目的是提供用重力流洗涤多孔过滤板检测法所用细胞 以获得细胞的高保留率的方法。本专利技术的一个附加目的是提供检测靶特异性试剂的方法，包括步骤a. 选出具有选定的靶分子的细胞，所述靶分子位于细胞壁上或细胞 内的位置上；b. 在多孔过滤板上培养细胞；c. 用包括针对细胞内或细胞上的选定的靶分子的配体的试剂接触细胞，配体选自由包括可检测标记物的配体和能够附着于含有可检测标记 物的第二配体的配体组成的组。d. 用重力流洗涤细胞至少一次，以便去除任何未与细胞的选定的靶分子结合的试剂，以提供洗涤过的细胞；和e. 搜索配体，以指示出是否存在靶分子(包括蛋白的功能状态的变 更例如蛋白质的磷酸化)。本专利技术另一个目的是提供作为本方法的配体的第一和第二抗体。 本专利技术另一个目的是提供作为本方法的配体的第一和第二抗体，以 及通过利用对与第一抗体结合的第二抗体的荧光、化学发光、比色或放 射性检测来检测第一抗体与靶分子的结合。本专利技术的一个目的是提供用于对洗涤液体和未结合试剂进行重力过 滤的装置，其是由过滤板、载体板、以及收集架组成的，所述过滤板具 有两个或多个孔，每个孔的底部都覆盖有多孔膜；所述载体板具有与过 滤板的孔数目相等且与过滤板的孔相对准的孔，载体孔具有开放的顶部 和底部。本专利技术的另一个目的是提供具有孔径约1到约5微米的亲水性膜的 过滤板，孔径优选地约为3微米。本专利技术的一个附加的目的是提供具有其内径至少要比与其相互作用 的过滤板的孔的外径稍微更大的载体板。本专利技术的另一个目的是提供具有亲水性膜的过滤板和具有其内表面 已经变成亲水性的孔的载体板。本专利技术的一个目的是提供由多孔过滤板、载体板、用于通过重力流 进行细胞洗涤的废液收集器组成的试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供由具有亲水性膜的多孔过滤板、载体 板、用于通过重力流进行细胞洗涤的废液/试剂收集器组成的试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供由具有孔径约为3微米的亲水性膜的多 孔过滤板、载体板、用于通过重力流进行细胞洗涤的废液/试剂收集器、 能够结合标记物蛋白的第一抗体和能够结合第一抗体的第二抗体组成的 试剂盒，其中第二抗体具有能够被检测到的实体。本专利技术的目的是提供具有能够通过荧光、比色或放射性而被检测到 的第二抗体的试剂盒。本专利技术的目的是提供具有能够被流式细胞术检测到的第二抗体的试 剂盒。附图说明图1显示了本专利技术的装置的实施方式的分解透视图。图2显示了本专利技术的装置的实施方式的分解横截面图。图3显示了本专利技术的装置所用的过滤板的实施方式的俯视图。图4显示了本专利技术的装置所用的虹吸装置的横截面图。图5显示了另一个实施方式的横截面图。图6用框图形式显示了本专利技术的方法。图7用框图形式显示了本专利技术的第二个方法。图8显示了实施例1的数据。图9显示了实施例2的数据。图10A和B显示了实施例3的数据。具体实施方式本专利技术是一种快速的、基于细胞的高通量检测法以及相关的试剂盒 和使用方法，其可以被用于例如筛选测试化合物对细胞生长和分化的作 用，如细胞的标记物蛋白的表达所指示的那样。下面详细描述了本专利技术 的组分。简单地，将细胞培养在过滤板上。过滤板包括具有孔隙的低磷 光背景的材料，其容许细胞培养于过滤板上并被原位洗涤。在洗涤步 骤，通过使用重力过滤使得细胞丢失最小化。板上的细胞与试剂接触，所述试剂包括与细胞的标记物分子(通常 是蛋白)和可检测试剂特异性结合的配体。可检测试剂可以是与螯合剂 螯合的稀土元素离子，同时螯合剂与配体结合，或者可检测试剂可以是 任何商品化可获得的抗体等，其具有与之所形成的或者与之相附着的可 检测实体。如果需要，可以在细胞与试剂接触之前去除细胞培养基。任 选地，可以将试剂直接地加入到细胞培养上清液中。直接加入避免了附 加的洗涤步骤，还增加了检测法的高通量性能。在洗涤细胞去除了未结合试剂之后，可以通过荧光、化学发光、放 射性或比色测定出与可测试试剂相关的检测。检测到实体表示配体与标 记物分子的结合，因此可以被用于检测出是否存在标记物分子。在一个 利用荧光的实施方式中，利用对荧光的时间分辨(time-resolved)荧光 测定可以使得基于细胞的检测法的高荧光背景的特征最小化。在本专利技术的一个实施方式中本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测靶特异性试剂的方法，包括步骤：　　　　ａ．选择具有选定的靶分子的细胞，所述靶分子位于细胞壁上或细胞内的位置；　　　　ｂ．在多孔过滤板上培养所述细胞；　　　　ｃ．用包括针对所选定的细胞内或细胞上的靶分子的配体的试剂接触所述细胞，所述配体选自含有可检测标记物的配体和能够与含有可检测标记物的第二配体相附着的配体；　　　　ｄ．用重力流洗涤细胞至少一次，以便去除任何未与细胞的选定的靶分子结合的试剂，以提供洗涤过的细胞；和　　　　ｅ．搜索配体，以指示出是否存在靶分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JY帕克，
申请(专利权)人：米利波尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]