一种检测农副产品中黄曲霉毒素Ｂ１的方法，其特征在于包括以下步骤： １）在石英晶体微天平金电极表面制备黄曲霉毒素Ｂ↓［１］压电免疫传感器； ２）制备纳米金标记的羊抗鼠ＩｇＧ抗体； ３）作标准工作曲线： 取不同浓度的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］标准溶液，加入常规浓度量的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］单克隆抗体，再加入牛血清白蛋白，混匀，取常规量滴到已制备好的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］压电免疫传感器，３７℃环境中反应３０ｍｉｎ；接着加入纳米金标记抗体（二抗），实时检测压电石英晶体微天平的频率变化；改变标准浓度的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］，按上述步骤测定一系列黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的标准溶液，用压电石英晶体微天平频率变化值与黄曲霉毒素Ｂ↓［１］浓度绘制标准工作曲线； ４）样品检测： 取处理好的样品溶液，加入常规浓度量的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］单克隆抗体，再加入牛血清白蛋白，混匀，取常规量滴到已制备好的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］压电免疫传感器，在３７℃环境中反应３０ｍｉｎ；接着加入纳米金标记抗体（二抗），实时检测压电石英晶体微天平的频率变化；实时检测压电石英晶体微天平的频率变化，记录频率变化值；将频率变化值与第３）步绘制的标准工作曲线对照获得样品中黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的数值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种检测农副产品中黄曲霉毒素B1的方法。
技术介绍
黄曲霉毒素B1是黄曲霉、寄生曲霉、特曲霉等的代谢产物，是I类致癌物，是一种毒性极强的真菌毒素。由于其对人体的危害，各国都对农副产品中黄曲霉毒素B1的最高允许浓度作出了严格的规定，建立黄曲霉毒素B1的高灵敏分析手段对农副产品监督与检测具有重大意义。现在使用的黄曲霉毒素B1检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫亲和柱荧光分光光度法、酶联免疫吸附法等。这些检测方法大都步骤繁琐，需特殊仪器，耗时长，不适宜现场快速筛查。因此，需要一种分析速度快、灵敏度高，可现场快速筛查的检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种检测农副产品中黄曲霉毒素B1的方法。本专利技术用于对农副产品中黄曲霉毒素B1的检测，具有分析成本低，分析速度快，灵敏度高，达到我国农副产品中黄曲霉毒素B1的限量标准。分析仪器便于携带，可实现现场监督与检测。为了达到上述目的，本专利技术提供的检测农副产品中黄曲霉毒素B1的方法包括以下步骤1、在石英晶体微天平金电极表面制备黄曲霉毒素B1压电免疫传感器；2、制备纳米金标记的羊抗鼠IgG抗体(二抗)；3、作标准工作曲线取不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液，加入常规浓度量的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，再加入牛血清白蛋白，混匀，取常规量滴到已制备好的黄曲霉毒素B1压电免疫传感器，37℃环境中反应30min；接着加入纳米金标记抗体(二抗)，实时检测压电石英晶体微天平的频率变化；改变标准浓度的黄曲霉毒素B1，按上述步骤测定一系列黄曲霉毒素B1的标准溶液，用压电石英晶体微天平频率变化值与黄曲霉毒素B1浓度绘制标准工作曲线；4、样品检测取处理好的样品溶液，加入常规浓度量的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，再加入牛血清白蛋白，混匀，取常规量滴到已制备好的黄曲霉毒素B1压电免疫传感器，在37℃环境中反应30min；接着加入纳米金标记抗体(二抗)，实时检测压电石英晶体微天平的频率变化；实时检测压电石英晶体微天平的频率变化，记录频率变化值；将频率变化值与第3步绘制的标准工作曲线对照获得样品中黄曲霉毒素B1的数值。本专利技术方法步骤1中所述黄曲霉毒素B1压电免疫传感器可以由以下步骤制备1)石英晶体微天平金电极表面的半胱氨自组装将金电极浸入2.0mmol/L的半胱氨水溶液中，静置过夜，取出金电极，金电极表面用纯水清洗三次，即在金电极表面获得一层致密均匀的半胱氨自组装单层膜；2)石英晶体微天平表面抗体固定化将自组装了半胱氨自组装单层膜的晶振浸入5.0％(V/V)戊二醛溶液中，静置1～1.5小时，取出金电极，金电极表面用纯水清洗三次，再将含10.0μg/mL黄曲霉毒素B1的牛血清白蛋白交联物溶液20μL滴至电极表面，静置1～1.5小时，电极表面用纯水清洗三次，取质量分数为1％的牛血清白蛋白溶液50μL滴至电极表面，静置封闭0.5小时，电极表面用纯水清洗三次，即获得黄曲霉毒素B1压电免疫传感器。本专利技术方法步骤2中所述纳米金标记的羊抗鼠IgG抗体的制备可按以下方法进行取纳米金胶体250μl，用0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液调节pH为9.0；取羊抗鼠IgG抗体5μl，逐滴加入到金溶胶中，强烈搅拌10min～20min，然后于室温孵育1～1.5h，初步制得纳米金标记抗体；加入质量分数为5.0％的牛血清白蛋白(BSA)溶液于纳米金标记抗体溶液中，使BSA最终质量分数为1.0％，封闭纳米金标记抗体；将纳米标记抗体置入1.5mL的离心管中，以15000r/min的速度冷冻离心10min，控制离心温度为4℃；弃去上层清液，用含质量分数为0.1％BSA的磷酸缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)洗涤暗红色沉淀物2次；将该沉淀物重新悬浮于质量分数为0.1％的BSA-PBS缓冲液中，制得纳米金标记抗体。本专利技术的检测原理本专利技术检测方法是基于利用压电晶体对质量变化的敏感性，结合生物识别系统(抗原抗体特异性结合)而形成的一种自动化分析检测系统，来检测农副产品中黄曲霉毒素B1浓度的。本专利技术中，黄曲霉毒素B1全抗原修饰压电石英晶体微天平传感界面，形成黄曲霉毒素B1压电免疫传感器。抗体与样品中黄曲霉毒素B1及固定化的黄曲霉毒素B1全抗原的竞争作用，同时，利用纳米金标记的二抗与一抗的免疫识别(二抗是在一抗的基础上制备的，对一抗有特异性识别作用)，实现大分子抗体的表面结合，进一步放大质量响应，质量放大可达数百万倍(压电晶体微天平本身就是对质量敏感的传感装置，由于纳米金的质量要远远大于抗体或抗原的质量，取不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液，加入常规浓度量的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，再加入牛血清白蛋白，混匀，取常规量滴到已制备好的黄曲霉毒素B1压电免疫传感器，37℃环境中反应30min，显然，黄曲霉毒素B1已经和黄曲霉毒素B1单克隆抗体先反应了，如果样品中黄曲霉毒素B1多的话，由于大部分黄曲霉毒素B1抗体已经和样品中的黄曲霉毒素B1反应了，那么连接到晶振表面的黄曲霉毒素B1抗体就少，进而纳米金标记的二抗上去的也就少。因此，本实验实际上其放大倍数与样品中的黄曲霉毒素B1的含量是成反比的，也就是说，样品中的黄曲霉毒素B1越少，那么连接到晶振表面的抗体反而越多，进而纳米金标记的二抗上去的也越多，质量放大越明显。正因为如此才会有高灵敏度。)，在30min内可以完成反应，记录频率变化值。本专利技术主要解决了黄曲霉毒素B1快速检测的系列问题由于黄曲霉毒素B1分子量小，压电质量响应小，本专利技术利用分析样中抗原与固定抗原对游离抗体的竞争作用，实现大分子抗体的表面结合，提高质量响应。同时，利用纳米金标记的二抗与一抗的免疫识别，进一步放大质量响应，实现黄曲霉毒素B1的高灵敏定量测定。本专利技术采用黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白(BSA)交联物(即全抗原)进行半抗原的固定，提高表面负载量与固定效率，简化传感器制作程序。通过实验条件的优化，本传感器对黄曲霉毒素B1的频率响应十分明显，但对其他真菌毒素几乎没有频率响应。表面修饰黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白封闭的免疫传感表面起了很好的抑制非特异性吸附的效果。传感器可用6.0mol/L尿素浸泡30min～40min再生。再生后传感器可反复使用而无显著灵敏度损失。制备的黄曲霉毒素B1压电免疫传感器检测步骤简单，检测时间不超过1小时，传感器界面再生简便，可以多次反复使用。检测灵敏度高，下限可达0.50ng/mL，分析精度相对误差在8.0％以内。检测所需的石英晶体微天平仪器便携且价格低廉。本专利技术可利用普通的免疫分析试剂，无需特殊标记，获得质量响应的大大提高，显著改善了传感器的灵敏度。分析成本低，分析速度快，灵敏度高，可达到我国农副产品中黄曲霉毒素B1的限量标准。仪器可便携，可实现现场监督与检测。具体实施例方式实施例1、制备黄曲霉毒素B1压电免疫传感器1)、石英晶体微天平金电极表面的半胱氨自组装将金电极浸入2.0mmol/L的半胱氨水溶液中，静置过夜，取出金电极，金电极表面用纯水清洗三次，即在金电极表面获得一层致密均匀的半胱氨自组装单层膜；2)、石英晶体微天平表面抗体固定化将自组装了半胱氨自组装单层膜的晶振浸入5.0％(V/V)戊二醛溶液中，静置1～1.5小时，取出金本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测农副产品中黄曲霉毒素Ｂ１的方法，其特征在于包括以下步骤：１）在石英晶体微天平金电极表面制备黄曲霉毒素Ｂ↓［１］压电免疫传感器；２）制备纳米金标记的羊抗鼠ＩｇＧ抗体；３）作标准工作曲线：取不同浓度的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］标准溶液，加入常规浓度量的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］单克隆抗体，再加入牛血清白蛋白，混匀，取常规量滴到已制备好的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］压电免疫传感器，３７℃环境中反应３０ｍｉｎ；接着加入纳米金标记抗体（二抗），实时检测压电石英晶体微天平的频率变化；改变标准浓度的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］，按上述步骤测定一系列黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的标准溶液，用压电石英晶体微天平频率变化值与黄曲霉毒素Ｂ↓［１］浓度绘制标准工作曲线；４）样品检测：取处理好的样品溶液，加入常规浓度量的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］单克隆抗体，再加入牛血清白蛋白，混匀，取常规量滴到已制备好的黄曲霉毒素Ｂ↓［１］压电免疫传感器，在３７℃环境中反应３０ｍｉｎ；接着加入纳米金标记抗体（二抗），实时检测压电石英晶体微天平的频率变化；实时检测压电石英晶体微天平的频率变化，记录频率变化值；将频率变化值与第３）步绘制的标准工作曲线对照获得样品中黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的数值。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭新凯，蒋健晖，胡朝晖，陈利国，
申请(专利权)人：长沙市产商品质量监督检验所，
类型：发明
国别省市：43
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