一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种同时检测多种黄曲霉毒素印刷电极电化学免疫传感器的制备方法和应用，属于生物传感、纳米功能材料及食品安全分析技术领域。本发明专利技术是在涂覆一层聚酯薄膜的矩形基片表面上印刷7个电极，其中包括5个碳工作电极，1个银参比电极和1个对电极，7个电极引出线及引出线端部。其特征在于，用银纳米粒子—氮掺杂石墨烯—羟丙基壳聚糖导电复合纳米材料将黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2以及总黄曲霉毒素的抗体固定到各工作电极表面，滴涂检测液后与多通道电化学工作站检测电路相连，从而实现了五种黄曲霉毒素的同时检测。本发明专利技术制备简单、加工方便、成本低、便于携带。该检测方法简单、快速、灵敏度高、特异性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物传感、纳米功能材料及食品安全分析
，具体是涉及一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器的制备方法及应用。
技术介绍
黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，产生的黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素Gl和黄曲霉毒素G2 (简称4种黄曲霉毒素)，普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中，可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全。黄曲霉毒素是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌，它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍，是目前公认的致癌性最强的物质之一。在发展中国家食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈正相关性，亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明，食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变呈正相关性，长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物是导致肝癌、胃癌和肠癌等疾病的主要原因。国家卫生部门禁止企业使用被黄曲霉毒素严重污染的粮食进行食品加工生产，并制定相关的标准监督企业执行，但对于含黄曲霉毒素浓度较低的粮食和食品无法进行控制。因此开发出一种能同时快速灵敏检测食品中多 种微量黄曲霉毒素的多通道印刷电极具有十分重要的意义。石墨烯，是已知材料中最薄的一种，且非常牢固坚硬；作为单质，它在室温下传递电子的速度比已知导体都快，它具有超薄、强韧、稳定、导电性好等诸多现有材料无法比拟的优点。氮原子掺杂石墨烯，可改变材料性能。拉曼光谱表明，氮掺杂改变了石墨烯薄片的电子特性，但不会干扰它的基本结构。氮原子放在平面石墨烯片内，每个氮原子键合三个相邻的碳，即每个氮原子取代薄片上的一个碳，可以制得高品质石墨烯，将其用于传感器的制备，使传感器的灵敏度和稳定性得到显著提高，改善了传感器的性能。壳聚糖在传感器的自组装过程中起到了非常好的作用，羟丙基壳聚糖是由壳聚糖改性而成的一种水溶性良好的壳聚糖衍生物，它既能溶于水又能溶于乙醇等有机溶剂，具有良好的乳化性、抗菌性、吸湿保湿性和表面活性，其吸湿保湿能力与透明质酸相当，乳化性和泡沫性与非离子表面活性剂TweeneO相当，其在传感器中的效果优于壳聚糖。目前测定黄曲霉毒素的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法。存在以下不足: (1)检测过程烦琐、耗时长，劳动强度大； (2)仪器设备昂贵、操作复杂，难以实现快速分析； (3 )灵敏度较差，且不能实现多种黄曲霉毒素的同时检测。针对上述不足，本专利技术提供一种操作方便、便携、成本低、快速灵敏检测食品中多种黄曲霉毒素的印刷电极电化学免疫传感器。
技术实现思路
本专利技术的技术方案，包括以下步骤。1.一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)在一个涂覆一层聚酯薄膜的矩形基片表面上，依次以银浆印刷I个参比电极，以导电碳浆印刷5个工作电极、I个对电极、7个电极引出线及引出线端部，并在所有电极及引出线端部以外的基片上，以绝缘浆印刷一层绝缘层，并在电极区域形成一个圆形电解池凹槽⑦，制得五通道丝网印刷电极； (2)在(I)所述的五通道丝网印刷电极的5个工作电极上，滴涂5 IOPL银纳米粒子一氮掺杂石墨烯一羟丙基壳聚糖的导电复合纳米材料溶液；所述导电复合纳米材料溶液，是将银纳米粒子与氮掺杂石墨烯按照一定的质量比进行混合超声分散30min，然后加上质量分数1.0%的羟丙基壳聚糖溶液超声混合30min，制成质量比为(I 5): (8 12): (Γ10)的银纳米粒子一氮掺杂石墨烯一羟丙基壳聚糖导电复合纳米材料溶液；所述羟丙基壳聚糖溶液，将I g羟丙基壳聚糖加入到99 mL水中搅拌2 h，制得质量分数1.0%的羟丙基壳聚糖溶液。 (3)在步骤(2)制得的5个工作电极上分别滴加5 ΙΟμ 的黄曲霉毒素BI抗体、黄曲霉毒素Β2抗体、黄曲霉毒素Gl抗体、黄曲霉毒素G2抗体及总黄曲霉毒素抗体，再以ΙΟμ ，质量分数为1%的牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性活性位点，制得一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器，置于4 °C下保存备用，所述抗体浓度均5 10 Pg/mL。2.一种同时检测多种黄曲霉毒素的方法，该方法包括以下步骤: (1)将黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素Gl和黄曲霉毒素G2(简称4种黄曲霉毒素)及总黄曲霉毒素的标准溶液分别滴涂到上述方法制备的一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器对应的工作电极表面上，孵化2 3 h，然后用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗干净，得到修饰好的工作电极； (2)将参比电极、工作电极和对电极连接在多通道电化学工作站上，在电解槽中加入5mmol/L的铁氰化钾溶液，通过循环伏安法检测所述修饰好的工作电极的电流响应； (3)根据所得电流响应与4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线； (4)用待测样品代替4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的标准溶液，按照所述4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素工作曲线的绘制方法进行检测，其检测结果对照所绘制的4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素工作曲线，计算出样品中4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的含量。所述一种同时检测多种黄曲霉毒素的方法实现了 4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素共5种组分的同时测定。所述一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器，所用原料均可以在化学试剂公司或生物制药公司购买。与现有技术相比，本专利技术的优势如下: (I)采用的印刷电极制备简单、成本低、便于携带、易于微型化和集成化；(2)采用印刷电极制成传感器，检测方法简单，灵敏度高、重现性好，应用范围广； (3)采用印刷电极制成传感器，与多通道电化学工作站的检测电路相连，能够实现五种组分的同时检测，更加方便快捷，且同步性好，能减小测量误差； (4)采用印刷电极制成传感器，采用免疫分析技术实现了不同种类黄曲霉毒素的特异性识别。附图说明图1是本专利技术的印刷电极结构示意图。图1中，①基片，②参比电极，③工作电极，④对电极，⑤电极引出线，⑥引出线端部，⑦圆形凹槽。图2是圆形凹槽内电极工作区域结构示意图。具体实施例方式 下面结合附图和实例进一步说明本专利技术。实施例1本专利技术所述的一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器的制备方法，结合图1，步骤如下。在一个涂覆一层聚酯薄膜的矩形基片①表面上，依次以银浆印刷I个参比电极②，以导电碳浆印刷5个工作电极③、I个对电极④、7个电极引出线⑤及引出线端部⑥，并在所有电极及引出线端部以外的基片上，以绝缘浆印刷一层绝缘层，并在电极区域形成一个圆形电解池凹槽⑦，制得一种五通道丝网印刷电极。实施例2本专利技术所述的一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器的制备方法，结合图1，步骤如下。(I)在实施例1制备的多通道印刷电极的5个工作电极上，滴涂5μ 银纳米粒子-氮掺杂石墨烯-羟丙基壳聚糖导电复合纳米材料；所述导电复合纳米材料中银纳米粒子和氮掺杂石墨烯的质量比为1: 8，超声混合30min，加上羟丙基壳聚糖溶液超声分散30min，制成质量比为1: 8:1的银纳米粒子一氮掺杂石墨烯一轻丙基壳聚糖导电复合纳米材料溶液； (2)在步骤(I)制得的5个工作电极上分别滴加5μ 浓度为10 Pg/mL的4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的抗体，再以IOPL、质量分数为1%本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在一个涂覆一层聚酯薄膜的矩形基片（①）表面上，依次以银浆印刷1个参比电极（②），以导电碳浆印刷5个工作电极（③）、1个对电极（④）、7个电极引出线（⑤）及引出线端部（⑥），并在所有电极及电极引出线端部以外的基片上，以绝缘浆印刷一层绝缘层，并在电极区域形成一个圆形电解池凹槽（⑦），制得五通道丝网印刷电极；（2）在（1）所述的五通道丝网印刷电极的5个工作电极上，滴涂5?~?10μL银纳米粒子—氮掺杂石墨烯—羟丙基壳聚糖构成的导电复合纳米材料溶液；所述导电复合纳米材料溶液，其特征是，将银纳米粒子和氮掺杂石墨烯一定的质量比进行混合超声分散30min，然后加上质量分数1.0%的羟丙基壳聚糖溶液超声混合30min，制成质量比为（1?~?5）:（8?~?12）:（1~?10）的银纳米粒子—氮掺杂石墨烯—羟丙基壳聚糖导电复合纳米材料溶液；（3）在步骤（2）制得的5个工作电极上分别滴加5?~?10μL的黄曲霉毒素B1抗体、黄曲霉毒素B2抗体、黄曲霉毒素G1抗体、黄曲霉毒素G2抗体及总黄曲霉毒素抗体，再以10μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性活性位点，制得一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器，置于4?℃下保存备用，所述抗体浓度均5?~?10?μg/mL。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜斌，魏琴，黎荣霞，于海琴，张勇，吴丹，李贺，马洪敏，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：