克伦特罗残留的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种克伦特罗残留的检测方法，包括如下步骤：（１）克伦特罗－小牛血清白蛋白偶联物的制备、鉴定和生物素化；（２）克伦特罗单克隆抗体在荧光微球上的偶联；（３）克伦特罗残留的悬浮芯片检测标准曲线的绘制；（４）克伦特罗残留的悬浮芯片检测的特异度测定；（５）待测样品克伦特罗残留浓度的测定。使用本发明专利技术的新型的克伦特罗残留的检测方法操作简单，灵敏快速，成本低廉，整个检测过程仅耗时１～２小时。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物食品中药物残留的检测方法，特别是涉及动物食品中克伦特罗残留的 检测方法。
技术介绍
近年来，食品的安全性已经成为社会共同关注的公共卫生问题，而兽药残留成为食品 安全性的重要影响因素。国内市场调査发现肉品、乳制品的抗生素和激素残留问题比较严 重，近年来，各种动物性食品中克伦特罗(CLenbuterol，CL)的残留问题已引起广泛关注。克 伦特罗俗称"瘦肉精"，CL是一种作用极强的p2受体激动剂，属于肾上腺素的类激素，滥用 会导致心率加速，肌肉震颤，代谢紊乱；特别是对于高血压、心脏病、甲亢、青光眼、前 列腺肥大等疾病患者危险性更大，可能会加重病情，导致意外或死亡。国家明令禁止在饲 料和词料添加剂中添加该物质，但一些词料和养殖企业仍然违禁使用，导致多起克伦特罗 残留引起的食物中毒事件发生。2001年我国浙江、广东、陕西等省发生了多起克仑特罗猪 肉食物中毒。对于动物食品中克仑特罗残留的检测，最新的国标(GB/T5009.192-2003)和行 业标准(NY/T468-2006)多以色谱法、色质联用和酶联免疫法(ELISA)等为主，国外也多以这 些方法为主。色-质联用和色谱法虽然灵敏度高，但实验室条件要求高，检测方法复杂，费 时费力，成本高，在实际中较难满足现场应用；ELISA法稳定性和重复性较差，检测范围 窄，假阳性率高。因此，这些方法不能满足当今快速灵敏准确的检测需要。悬浮芯片技术是美国Luminex公司开发的一种多功能的液相芯片分析平台，它和传统 意义上的固相芯片有所不同。该系统的检测载体为两种被染上不同荧光染料的聚苯乙烯微 球，每种微球上根据荧光染料的不同被定义上一个唯一的编码地址；同时微球上固定有针 对不同靶标物的探针，如果液相中存在有该检测物，则可以被微球所捕获。结合后，悬浮 芯片系统采用2种激光进行检测，红色激光可定位微球的编码地址，从而将各个不同的分 析反应区别出来；绿色激光激发的是荧光报告分子链霉亲和素-R-藻红蛋白(Srtreptavidin-PE， SA-PE)，确定微球上结合的报告荧光分子的数量。由于荧光报告分子是与靶分子通过 共价键直接连接或间接连接，从而可以确定微球上结合靶分子的量来测得靶标物的浓度。 液相环境中更有利于保持生物活性物质的天然构象和活性，有利于探针和被检测物的反应， 在大多数的反应中不需要洗涤步骤，不会破坏反应的动态平衡，既具有固态片膜芯片高通 量的特性，又具有优于它的^作简便、重复性好、灵敏度高等优点；与固相芯片相比，液 相芯片具有灵活性更好，可以根据需要调节每次检测所需要的微球的数量和调整检测体系的设计。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种操作简单，灵敏快速，成本低廉的 。本专利技术的技术方案概述如下(1) 克伦特罗-小牛血清白蛋白偶联物的制备、鉴定和生物素化；(2) 克伦特罗单克隆抗体在荧光微球上的偶联；(3) 克伦特罗残留的悬浮芯片检测标准曲线的绘制；(4) 克伦特罗残留的悬浮芯片检测的特异度测定；(5) 待测样品克伦特罗残留浓度的测定。优选的是步骤(l)克伦特罗-小牛血清白蛋白偶联物的制备、鉴定和生物素化为将克 伦特罗标准品通过重氮化法与小牛血清白蛋白偶联，获得克伦特罗-小牛血清白蛋白偶联 物，通过紫外分光光度法进行鉴定；再将所述克伦特罗-小牛血清白蛋白偶联物与生物素 N-羟基丁二酰亚胺酯偶联，得到克伦特罗-小牛血清白蛋白-生物素偶联物。所述步骤(2)克伦特罗单克隆抗体在荧光微球上的偶联为先将荧光微球用偶联试剂 l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化，然后将克伦特 罗单克隆抗体通过氨基化反应偶联于所述活化的荧光微球上，制成偶联有克伦特罗单克隆 抗体的荧光微球。 ，所述步骤(3)克伦特罗残留的悬浮芯片检测标准曲线的绘制为将克伦特罗标准品按照5X梯度用水稀释成7个梯度，在预先润湿的Millipore96孔渗滤板的反应孔中分别加入100ng 的克伦特罗-小牛血清白蛋白-生物素偶联物和所述7种梯度不同的克伦特罗标准品，另设一 阴性对照，使每孔中克伦特罗的终浓度达到50, 250,1250, 6250， 31250, 156250, 781250pg/mL, 再加入克伦特罗单克隆抗体的荧光微球反应l小时，向每孔加入适量链霉亲和素-R-藻红蛋 白，37'C温育半小时，悬浮芯片读取500个微球，获得中位荧光强度值，由配套软件 Bio-Manager4.0分析处理并绘制检测标准曲线。所述步骤(4)克伦特罗残留的悬浮芯片检测的特异度测定为在预先润湿的Millipore96 孔渗滤板的反应孔中分别加入100ng的克伦特罗-小牛血清白蛋白-生物素偶联物和不同浓 度的克伦特罗的类似物沙丁胺醇或莱克多巴胺，使终浓度分别达到50pg/mL， 1250 pg/mL 和31.25ng/mL，共6孔，再加入克伦特罗单克隆抗体的荧光微球反应1小时，向每孔加入 适量链霉亲和素-R-藻红蛋白，37t:温育半小时，并和阴性对照比较。所述步骤(5)待测样品克伦特罗残留浓度的测定为对待测样品进行检测，Bio-Plex悬 浮芯片检测系统检测出中位荧光强度值，由配套软件Bio-Manager4.0根据步骤(3)绘制出的 检测标准曲线自动获得测试浓度值。使用本专利技术的新型的操作简单，灵敏快速，成本低廉，整个 检测过程仅耗时1 2小时。附图说明图1为克伦特罗检测的标准曲线图。具体实施方式下面的实施例用于说明本专利技术但并不限 实施例h实验材料如下克伦特罗(CL)单克隆抗体(Abcam公司)克伦特罗，生物素N-羟基丁二酰亚胺酯，N,N-二甲基甲酰胺(DMF) (SIGMA公司)链霉亲和素-R-藻红蛋白(phycoerythrinSA-PE) (Invitrogen公司)小牛血清白蛋白(Roche公司)沙丁胺醇和莱克多巴胺(Dr.Ehrenstorfer公司)Millipore96孔渗滤板(Millipore公司)Multiscreen 抽滤系统(Millipore公司)悬浮芯片检测系统Bio-Plex Suspension Array Workstation及配套Bio-Manager 4.0软件和46 号带有羧基的编码荧光检测微球(Bio-Rad公司)，微球的特征是直径为5.5Wn的聚苯乙烯 微球，微球上带有羧基基团，在其表面染有2种不同的红色荧光染料。这两种染料各有10 种浓度梯度，因此通过不同浓度的染料的搭配， 一共可以编码出102即100种微球，对待 测样品进行检测可以选取任意编号的。(1) 克伦特罗-小牛血清白蛋白偶联物的制备、鉴定和生物素化① 采用重氮化法制备克伦特罗-小牛血清白蛋白偶联物；② 将偶联反应后的反应液移入透析袋中，置于0.01mol/L磷酸盐充分透析。将透析后 的偶联物克伦特罗-小牛血清白蛋白分装、冷冻储存备用，避免反复冻融；③ 将克伦特罗、小牛血清白蛋白和克伦特罗-小牛血清白蛋白偶联物分别用磷酸盐缓冲 液溶解并稀释至合适浓度，在200-400nm波长范围紫外吸收波长连续扫描，经紫外分光光 度法证明克伦特罗与小牛血清白蛋白成功偶联，并根据朗伯-比尔定律和紫外吸光值的可叠 加原理，得出反应获得的偶联物中克伦特罗与本文档来自技高网...

【技术保护点】
克伦特罗残留的检测方法，其特征是包括如下步骤：　　　　（１）克伦特罗－小牛血清白蛋白偶联物的制备、鉴定和生物素化；　　　　（２）克伦特罗单克隆抗体在荧光微球上的偶联；　　　　（３）克伦特罗残留的悬浮芯片检测标准曲线的绘制；　　　　（４）克伦特罗残留的悬浮芯片检测的特异度测定；　　　　（５）待测样品克伦特罗残留浓度的测定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，刘楠，苏璞，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]