固定化的探针和检测构象改变的朊病毒蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了产生特异于朊病毒蛋白的固定化探针的方法，使用这种探针来结合、检测和从样品除去朊病毒蛋白的方法，和用于实践本发明专利技术的试剂盒。本发明专利技术公开了即使在暴露于一般将改变探针的活性和特异性的条件下时，被锁定在具有特定的、预定的结构并保持了它们的活性和特异性的固定化的探针。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及错折叠的蛋白，例如与疾病状况相关的那些蛋白的检测领域。更特别地，本专利技术涉及用于检测样品中构象改变的蛋白和朊病毒的方法、探针和试剂盒。在一个实施方案中，构象改变的蛋白和朊病毒与淀粉样变性疾病相关。
技术介绍
正常可溶蛋白质转化成构象改变的不溶蛋白被认为是各种疾病中的致病性过程。在这些疾病中，结构上的构象变化一般是正常的可溶性和功能性蛋白转化成定义的不溶状态所需的。这种不溶蛋白的实例包括阿尔茨海默氏病(AD)和大脑淀粉样血管病(CAA)的淀粉样斑块中的Aβ肽；帕金森氏病的Lewy体中沉积的α-突触核蛋白、额颞性痴呆(frontal temporaldementia)和皮克(Pick′s)病中神经原纤维缠结中的tau；肌萎缩性侧索硬化中的过氧化物歧化酶；亨廷顿病中的亨廷顿蛋白；和Creutzfeldt-Jakob病(CJD)中的朊病毒。对于综述，参见Glenner et al.，J.Neurol.Sci.941-28，1989；Haan et al.，Clin.Neurol.Neurosurg.92(4)305-310，1990。通常，这些高度不溶的蛋白形成由具有共同特征β折叠片层构象的非分支纤丝组成的聚集物。在CNS中，淀粉样可以存在于大脑的血管和脑膜血管中(脑血管的沉积)以及脑实质中(斑块)。在人类和动物模型中的神经病理研究表明，邻近淀粉样沉淀的细胞在它们的正常功能方面受到影响。(Mandybur，Acta Neuropathol.78329-331，1989；Kawai et al.，Brain Res.623142-146，1993；Martin et al.，Am.J.Pathol.1451348-1381，1994；Kalaria etal.，Neuroreport 6477-80，1995；Masliah et al.，J.Neurosci.165795-5811，1996)。其他研究还表明，淀粉样纤丝可以实际上启动神经变性。(Lendon etal.，J.Am.Med.Assoc.277825-831，1997；Yankner，Nat.Med.2850-852，1996；Selkoe，J.Biol.Chem.27118295-18298，1996；Hardy，Trends Neurosci.20154-159，1997)。在AD和CAA中，主要的淀粉样成分是淀粉样beta蛋白(Aβ)。通过两种推定的分泌酶的作用从淀粉样beta前体蛋白(APP)产生的Aβ肽，在正常的CNS和血液中以低水平存在。两种主要的变体，Aβ1-40和Aβ1-42是由APP的选择性羧基末端截短产生的(Selkoe et al.，PNAS USA 857341-7345，1988；Selkoe，Trends Neurosci.16403-409，1993)。Aβ1-42是AD和CAA的淀粉样沉淀物中的两种肽中更容易产生纤维(fibrillogenic)且更为丰富的。除了上述AD病例中的淀粉样沉淀物之外，大多数AD病例也与血管壁中的淀粉样沉淀有关(Hardy，1997，supra；Haan et al.，1990，supra；Terry et al.，supra；Vinters H.V.，Cerebral amyloid angiopathy，Stroke Mar-Apr；18(2)311-324，1987；Itoh Y，et al.Subpial beta/A4 peptide deposits are closely associated withamyloid angiopathy in the elderly，Neurosci.Lett.155(2)144-147，Jun.11，1993；Yamada M.，et al.，Subarachnoid haemorrhage in the elderlyanecropsy studyof the association with cerebral amyloid angiopathy，J Neurol.Neurosurg.Psychiatry 56(5)543-547，May，1993；Greenberg S.M.，et al.，The clinicalspectrum of cerebral amyloid angiopathypresentations without lobarhemorrhage，Neurology 43(10)2073-2079，Octobe 1993)。这些血管的病变是CAA的标志，其可以在没有AD时存在。人类transthyretin(TTR)是由四个相同的、主要是β片层结构的单元组成的正常血浆蛋白，它充当了激素甲状腺素的转运子。TTR异常自组装成淀粉样纤丝引起两种形式的人类疾病，即老年系统性淀粉样变性(SSA)和家族性淀粉样多发性神经病(FAP)(Kelly，Curr.Opin.Struct.Biol.6(1)11-17，1996)。FAP中淀粉样形成的原因是TTR中的点突变；SSA的原因是未知的。通过在活检材料中原位检测淀粉样沉淀物，在组织学上确立了临床诊断。迄今为止，关于TTR体内转化成淀粉样的机制所知很少。然而，几个实验室已经证明了通过正常人TTR的部分变性可以在体外模拟淀粉样转化(McCutchen et al.，Biochemistry 32(45)12119-12127，1993；McCutchen andKelly，Biochem.Biophys.Res.Comm.197(2)415-421，1993)。构象转变的机制涉及单体的构象中间体，其聚合成线性的β片层结构状淀粉样纤丝(Lai et al.，Biochemistry 35(20)6470-6482，1996)。通过与稳化分子，例如甲状腺素或triiodophenol结合，可以缓和(mitigate)这种过程(Miroy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(26)15051-15056，1996.)神经炎性斑块形成的确切机制和斑块形成与疾病相关性神经变性过程的关系没有很好地确定。公知阿尔茨海默病和朊病毒疾病患者的脑中淀粉样纤丝引起某些细胞的炎性活化。例如，通过纤丝的β-淀粉样和朊病毒肽刺激原代小胶质细胞培养物和THP-1单核细胞系来活化相同的酪氨酸激酶依赖性炎症信号转导级联。由β淀粉样和朊病毒纤丝引发的信号反应导致神经毒性产物的产生，其对于神经变性负有部分责任(Combs et al.，J.Neurosci.19928-939，1999)。朊病毒是在人类和动物中引起中枢神经系统海绵状脑病的感染性病原体。朊病毒不同于细菌、病毒和类病毒。潜在的朊病毒前体是称为PrP27-30的蛋白，一种在感染的脑中作为斑块发现的、多聚化(聚集)成棒样细丝的28千道尔顿疏水性糖蛋白。正常的蛋白同源物不同于朊病毒之处在于它是可容易地降解的，而朊病毒对蛋白酶有高度的抗性。已经表明朊病毒可能含有极其少量的高感染性核酸，通过常规的分析方法不可检测出(BenjaminLewin，″Genes IV″，Oxford Univ.Press，New 本文档来自技高网...

【技术保护点】
将朊病毒蛋白特异性探针固定到固相支持物的方法，所述方法包括　　　　提供处于预先选定的构象中的第一朊病毒蛋白特异性肽探针；　　　　提供固相支持物；和　　　　在维持所述第一探针处于其预先选定的构象中的条件下以及在允许所述第一探针固定到所述固相支持物的条件下，使所述固相支持物暴露于所述第一探针，持续足够的时间使得所述第一探针固定在固相支持物上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛迪S奥泽，潘韬，
申请(专利权)人：阿德利夫股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]