本发明专利技术涉及一种通过被抗体组吸附表面基质上捕获的生物标志，用标准化质控血清控制下的定量性质谱分析来检测。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群。本发明专利技术的方法可用于检测已经脱离人体的体液中的生物标志组合。这些生物标志组合可以用于同时鉴别正常人及不同种类的病人离体体液的试剂盒的检测方法。本方法精确、方便且快捷。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及 -种新的生物样品中蛋白质分析方法， 一种通过能与抗体结合的基质去捕 获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测生物标志。在此提及的此项专利技术涉及疾 病检测领域，为一种新的非侵入性的体外检测方法。更确切地讲，此专利技术涉及到生物标志 (biomarkers)，而这些抗原或生物标志能被以更高的特异性和灵敏度的抗体组及定量控 制的质谱将多种疾病一次性区分出来。本专利技术可以应用到已经脱离人体的体液中的生物标 志组合的检测方法或试剂盒开发。
技术介绍
随着人类基冈组计划的实施和完成,科学家们提出了后基因组(post-genome)计划的 概念，研究要点转移到功能基因组学上，而生物功能主要体现物质是蛋白质。1994年， 澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋白质组(prot固e)的概念， 指的是"一种基肉组所表达的全部蛋白质"，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部 蛋白质。对于蛋白质组的研究是功能基因组学研究的核心，称为蛋白质组学(proteomics)。 蛋白质组学被认为是后基丙组研究中最主要的部分。与基因组相比，蛋白质组的组成更复 杂，功能更活跃，应用前景更广泛。蛋白质组学从细胞整体水平进行蛋白质属性的研究， 如表达水平、翻译后修饰及相JJ作用等，并由此获得对于疾病过程、细胞生理生化特征和 调控M络的广泛完整的认识。所以，蛋白质组学技术正在逐步成为生物学、医学及制药学 等的重要研究手段。不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功 能。W此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛査，并最终用 于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细 胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的 方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。 用抗体及质谱联合可克服这一技术缺点。本专利技术用抗体组及质谱联合可同时检测出多种(三种以上)的生物标志的方法。如， 血库筛查要求特异性地检测出常见病毒微生物疾病的已知标记。但是，制备特异性结合标记并且能在复杂的混合物中鉴别出标记的试剂需要大量时间，这阻碍了此类体外诊断试剂 盒方法的发展。Fl前，还没有一种方法能够将四种以上疾病标志物同时检出。ELISA (enzyme-linked i隱unosorberr, assay)试剂盒等利用抗体可以用于检测一种疾病标志 物。利用抗体及二色免疫荧光，最多可以做到检测三种疾病标志物，但二种以上疾病标志 物就无法同时检测。利用抗体组与质谱仪联合应用，即可以解决同时鉴别二种以上的病毒 或微生物抗原标志物。举例讲，将抗HBV (HBsAg)抗体，抗HCV抗体，抗HIV p24 antigen (Ribas SG et al. Performance of a quantitative human immunodeficiency virus type 丄 p24 antigen assay on various HIV-1 subtypes for the follow-up of human immunodeficiency type 1 seropositive individuals. J Virol Methods 2003; 113: 29-34) 及抗梅毒抗体 (anti- treponemal 17 kDa protein) (George R et al. An analysis of the value of some ant丄gen—an'(:ibody interactions used as diagnostic indicators in a treponemal Western blot (TWB) test for syphilis. J Clin Lab Immunol 1998; 50: 27-44)等抗体联合标记至Protein A或G的支持物(磁性珠子、芯片等)上。由于每种 特异体抗体捕获生物抗原的分子量是不同的，故Protein A/G-抗体与质谱仪联合应用时， 质谱仪就非常容易地将这四种抗原同时分开了。由此推理，如果同时选择四种以上的抗体， 而这四种以上抗体所结合的抗原分子量是不同的，则本专利技术可同时区分四种以上不同种类 的疾病。本专利技术可以检测窗口期的献血者，这比单纯的ELISA抗体试剂盒更安全(LauDT， et al. A rapid i隱unoch:romatographic assay for hepatitis B virus screening. J Viral H印at 2003; 10: 331-334)。另外，本专利技术的方法可同时检测出多种变异的生物标志。抗体与质谱仪联合应用是--种高灵敏度、高准确性的检测方法，它能从一个不同成分的混合体系中检査和区分不同组 分、不同分子量(差别在1或2个氨基酸之间)的生物标志(蛋白质)。将来，它可能成为临 床上许多疾病检测的新模式，作为临床检查的常规方法。举例，区别胃癌中血清纤维蛋白 肽A及变异的纤维蛋白肽A，应用以往方法不能确定哪种肽类片段与发病有关，现在可以 抗体与质谱仪联合应用，将其中这种组分和它们的分子量清晰区分开来，并找到与该病发 病有关的特殊组分，这是分子医学的革命。本专利技术的方法可同时检测出多种修饰生物标志。 修饰的生物标记群指的修饰蛋白质为甲基化、乙酰化、羟基化、磷酸化修饰等。在人类肿瘤的发生发展过程中，过i对肿瘤临床检测一直停留在细胞水平上，因此临床医生长期盼望的真正意义上的早期诊断(如实体瘤在尚未形成包块以前，白血病在骨髓细胞检查不能 确诊以前)是不可能实现的。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种在生物样品中检测正常人与某种或多种疾病在离体血液中 生物标志的方法。此专利技术涉及到生物标志(biomarkers)，而这些生物标志能被用来以更 高的特异性和灵敏度将某种或多种疾病患者同时区分出来。该方法为疾病的早期检测提供 了新的途径，并为进一步发现新的变异的或修饰的生物标志提供了基础。本专利技术涉及一种通过标记特异性抗体至能与抗体结合的基质表面，并用定量性质谱分 析来同时检测某种疾病的多种生物标志或多种疾病状态。生物标志群可以是不变异的、变 异的、修饰的。变异的的生物标志群是指变异蛋白质为增加或减少一个或多个氨基酸。修 饰的生物标记群是指修饰蛋白质为甲基化、乙酰化、羟基化、磷酸化修饰等。本专利技术中的生物标志是利用 一 台质谱仪来发现的。该设备的质量精确度约为 +/-0.1%。基质是任何能与抗体选择性或特异性结合的物质。举例说明，Protein A和G基质吸 附抗体Fc段的功能。具有吸收剂功能的Protein A和G底基与抗体结合，抗体结合血清 中生物标志。经过一段足够的时间使生物标志能与抗体-Protein A和G结合。底基洗i 未吸附的物质。任何适宜的洗液均可使用。生物标志首先能够被具有能与生物标志物结合的抗体-基质吸附表面捕获，非吸附物 能从基质上洗脱，吸附到底基的生物标志物在质谱仪中被检测。生物标志通过离子发生 源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用含有抗体组的基质去捕获生物样品中生物标志的分析方法，其特征是采用质谱法对样品中已被抗体组捕获的生物标志进行精确地鉴别、检测的方法。该方法通过以下步骤实现： （１）样品处理及质谱标准化质控血清制备； （２）基质与多种抗体结合试剂盒制备、样品上样； （３）洗涤； （４）质谱的定量控制及质谱测试； 其中所述步骤（１）将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用Ｏ型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清；所述步骤（２）将质谱的标准化质控血清及样品点样在有支持物的基质中的一个位点上。支持物可用金属片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚体、液相色谱柱子或Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ等。基质是任何能与抗体选择性或特异性结合的物质；所述步骤（３）用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留１０秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用水彻底洗涤整个阵列点，自然干燥基质及滞留的生物标志；或用三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点（当用陶瓷珠、磁性珠、多聚体、液相色谱柱子或Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ为支持物时），将生物标志洗脱至质谱专用金属片或位点上。所述步骤（４）加０．５μＬ吸能分子（以５０％乙腈，０．５％三氟乙酸的制备的饱和标准溶液）用质谱仪去分析滞留与各位点的生物标志或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用质谱仪去分析。用计算机分析数据。定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰４０９１．１Ｄａ或６６３４．０ Ｄａ强度调至５０％信号强度的最大值。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许洋，
申请(专利权)人：许洋，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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