采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特点是首先以荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品进行免疫共培育，然后以核酸染料对待测样品进行染色，最后以多参数流式细胞术对待测样品进行测定与分析，根据检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对象的数量来对待测样品中结核杆菌的检测结果进行分析和判断。本发明专利技术方法将荧光纳米颗粒的信号放大作用与能同时进行多参数、快速检测的流式细胞术有机地结合，具有快速、灵敏度高的优点，通过增加核酸染料的染色，能够大大降低检测的假阳性率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细菌的检测方法，具体涉及一种结核杆菌的检测方法。
技术介绍
结核杆菌感染所引起的结核病是威胁人类健康的重要传染性疾病之一，本世纪80年 代中期以来在全球出现回升趋势。目前，全世界已有三分之一的人口受结核杆菌感染， 每年新发病例超过800万人，死亡病例超过200万人。因此，结核杆菌的快速、灵敏检 测对于结核病的诊断、管理与控制具有十分重要的意义。传统的结核杆菌检测方法主要有涂片抗酸染色法和培养法，目前医院对结核病的诊 断仍然依赖于这两种方法。涂片抗酸染色法快速简便，但灵敏度很低；改良罗氏培养基 培养法灵敏度高，但耗时长，通常需4 6周方可确定结果。近年来，许多快速检测结核 杆菌的方法陆续发展起来，包括结核杆菌快速培养兼鉴定系统，如BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统等；分子生物学方法，如聚合酶链反应(PCR) 法、核酸探针等；免疫学方法，如酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫色谱分析(ICA) 等。这些方法对提高检测的灵敏度和准确性做出了巨大的贡献，但仍存在一些不足之处。 例如，结核杆菌快速培养系统极大地縮短了细菌的培养时间，但仍需要数日；PCR法灵 敏度很高，但容易出现假阳性和假阴性问题；ELISA法简单价廉，但其灵敏度有待提高。 因此，探求准确、快速、灵敏地检测结核杆菌的方法一直为医学界所关注。流式细胞术(FCM)是利用流式细胞仪对细胞或其他微小生物颗粒的多种物理、生 物学参数同时进行定量分析的技术，它能在单细胞水平辨认细胞形态、大小和荧光特征， 具有检测速度快、采集数据量大、能同时进行多参数检测、方法灵活客观等优良特性， 目前已成为一种重要的细菌检测手段，并应用于环境、食品以及生物医学等相关领域。 将流式细胞术应用于结核杆菌的快速检测无疑是一种新的机遇。然而，由于细菌体积微 小、各种菌体成份含量相对较低，因此采用流式细胞术来实现对细菌的高灵敏检测仍然 是一种挑战。传统荧光染料作为标记物其荧光强度已难以满足高灵敏检测的需要，因而 需要发展更明亮的荧光标记物。近年来，各种发光纳米颗粒，包括量子点、荧光乳胶颗 粒以及二氧化硅荧光纳米颗粒等，由于具有更高的荧光强度和更好的光稳定性而成功地应用于生物标记及病原菌检测等领域。这些发光纳米颗粒标记技术为采用流式细胞术来 实现对细菌的高灵敏检测提供了一种新的思路。曾有研究小组尝试用量子点标记抗体与 流式细胞术相结合用于隐孢子虫卵的检测，但意外的是，检测结果竟不如传统有机染料， 主要是因为量子点本身带来了很多的假阳性信号 一方面，量子点的团聚使背景噪声显 著增大，从而导致假阳性增大；另一方面，量子点对样品中颗粒性杂质的非特异性吸附 造成假阳性增大。因此，发展新方法以克服上述假阳性问题成为采用发光纳米颗粒作为 标记物与流式细胞术结合来实现对细菌高灵敏检测这一技术的关键。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种检测时间短、检测灵敏 度高且假阳性率低的釆用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种采用双色流式细胞术检测结核 杆菌的方法，其特征在于首先以荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品进行免疫 共培育，然后以核酸染料对培育后的待测样品进行染色，最后采用多参数流式细胞术对 染色后的待测样品进行测定，根据检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对象的数 量来对待测样品中结核杆菌的检测结果进行分析和判断，所述的荧光双阳性信号为由荧 光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物所发出的不同颜色的荧光信号。所述荧光纳米颗 粒标记的结核杆菌抗体用于灵敏、特异性地对结核杆菌进行免疫荧光染色，而核酸染料 用于对细菌进行核酸染色以区分细菌与待测样品中的其它颗粒性杂质，整个检测过程(包 括样品预处理)可在2 3h完成。上述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物具有不同的荧光最大发射波长，且两 者之间的差值不小于45mn。上述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物的荧光最大激发波长、荧光最大发射 波长均处于300 700nm之间。上述荧光纳米颗粒可以选用嵌合联吡啶钌配合物(Ru(BPY)3)的二氧化硅荧光纳米 颗粒，所述核酸染料可以选用SYBR Green I。作为本专利技术的进一步改进，上述技术方案具体包括以下检测步骤(1)对待测样品进行免疫荧光染色利用以结核杆菌细胞壁抗原为免疫原的结核杆 菌抗体能与结核杆菌特异性结合这一特性，将嵌合联吡啶钌配合物的二氧化硅荧光纳米 颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品在缓冲液中于35 37'C培育1 2h;当样品中含有 结核杆菌时，结核杆菌细胞壁就会结合上大量荧光纳米颗粒，形成荧光纳米颗粒-结核杆菌复合物；(2) 对待测样品中的细菌进行核酸染色:利用核酸染料SYBR Green I能与双链DNA 迅速结合并发出明亮的荧光且背景荧光低这一特性，在免疫培育后的待测样品中加入核 酸染料SYBR Green I，室温下染色15 20 min;当样品中含有结核杆菌时，核酸染料SYBR Green I会渗透进入结核杆菌中并与其双链DNA结合，形成SYBR Green I-双链DNA复 合物，借此将结核杆菌与待测样品中的其它颗粒性杂质区分开来；(3) 多参数流式细胞术的测定与分析采用流式细胞仪对上述经过荧光纳米颗粒标 记的抗体和核酸染料SYBR Green I双染色后的待测样品进行测定，若待测样品中含有结 核杆菌，则经过上述步骤(1)和(2)的染色后，会同时形成荧光纳米颗粒-结核杆菌复 合物和SYBR Green I-双链DNA复合物，通过流式细胞仪配置的488 nm的氩离子激光器 激发，荧光纳米颗粒会发出红色荧光，而被核酸染料SYBR Green I染色的结核杆菌还会 同时发出绿色荧光，两种颜色的荧光信号能被仪器同时检测到，通过统计单位体积中具 有红色荧光和绿色荧光双阳性信号的对象的数量，来对待测样品中结核杆菌的检测结果 进行分析和判断；当单位体积中红色荧光和绿色荧光双阳性信号的数量小于或等于"背 景信号+3倍噪声"时，可判断待测样品中不含有结核杆菌。所述背景信号和噪声分别指 五组不含有结核杆菌的阴性对照样品所测得的单位体积中双阳性信号数量的平均值和标 准偏差。与现有技术相比，本专利技术方法通过将荧光纳米颗粒的信号放大作用与流式细胞术能 同时进行多参数、快速检测的特点有机地结合在一起，大大縮短了检测时间，与使用普 通有机染料作为荧光标记物的传统流式细胞术相比，具有更高的检测灵敏度；在荧光纳 米颗粒标记的特异性抗体识别的基础上，增加核酸染料作为第二步的确证，这不仅极大 地减小了荧光纳米颗粒团聚所造成的高背景噪声，同时也减少了荧光纳米颗粒与样品中 颗粒性杂质的非特异性吸附所造成的假阳性信号，与采用发光纳米颗粒作为荧光标记物 的单色流式细胞术相比，显著地降低了检测方法中的假阳性率。此外，本专利技术方法所使 用的核酸染料能有效区分细菌与样品中其它的颗粒性杂质，因而在进行样品测定前无需 通过离心、过滤等洗涤步骤将过量的未与目标细菌结合的纳米颗粒-抗体复合物除去，因 此可减小洗涤过程中所造成的细菌团聚与损失，进一步简化了检测步骤、縮短了检测时 间。附图说明图1为实施例1中分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用双色流式细胞术检测结核杆菌的方法，其特征在于：首先以荧光纳米颗粒标记的结核杆菌抗体与待测样品进行免疫共培育，然后以核酸染料对培育后的待测样品进行染色，最后采用多参数流式细胞术对染色后的待测样品进行测定，根据检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对象的数量来对待测样品中结核杆菌的检测结果进行分析和判断，所述的荧光双阳性信号为由荧光纳米颗粒和核酸染料－细菌核酸复合物所发出的不同颜色的荧光信号。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王柯敏，秦迪岚，何晓晓，谭蔚泓，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]