一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体重组基因的构建方法及其应用，所述双特异性嵌合抗原受体包括抗CD32a单链抗体以及抗HIV gp120单链抗体，所述抗CD32a单链抗体的编码核苷酸序列以及抗HIV gp120单链抗体的编码核苷酸序列在双特异性嵌合抗原受体编码基因中以串联形式连接。本发明专利技术的双特异性嵌合抗原以HIV复制增殖的标志物融合蛋白gp120和潜伏期的标志物胞膜蛋白CD32a为靶点，设计双靶点CAR‑T细胞，能够彻底清除HIV感染的靶细胞，具有巨大的临床推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用
本专利技术涉及医药生物领域，具体是指一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、其编码基因、构建方法及其应用。
技术介绍
艾滋病(AIDS)是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒(HIV病毒)引起。HIV主要攻击目标是CD4+T淋巴细胞，大量破坏该细胞，导致免疫功能缺陷，易发感染、恶性肿瘤，病死率较高。尽管抗HIV新型药物和其他疗技术大大提高了AIDS患者的生存率，并延长了生存时间。但HIV的高突率、抗病毒药物无法清除的潜伏病毒库和免疫重建不全，仍是三大科学挑战。高效抗逆转录病毒治疗(HAART)是HIV/AIDS治疗史上的第一次革命，其极大的降低了HIV/AIDS的发病率和病死率，显著延长了患者寿命，甚至降低了HIV的传播。但也面临着很多挑战：1)患者必须终生服药，需付出昂贵的经济代价；2)严重的毒副作用；3)耐药毒株的出现；4)更为重要的是cART不能彻底清除病毒，主要是因为药物仅对复制中的病毒有效，而对HIV在感染早期建立的潜伏性病毒“储藏库”(reservoir)是无效的。一旦抗逆转录病毒治疗中断，病毒储藏库中的整合前病毒再度激活，几乎所有患者体内病毒血症会迅速反弹。对淋巴瘤的治疗主要是化疗的方法，副作用大且容易复发，无可供使用的疗法。但HIV合并恶性肿瘤患者一般病情严重，患者免疫系统遭受严重损伤，病情进展较快，患者病死率较高，对此，如何选择有效的治疗方案已迫在眉睫。艾滋病治疗的根本目标是清除体内所有HIV病毒，以及HIV感染的细胞，包括激活状态的和潜伏状态的。由于gpl20和gp41在潜伏细胞中不表达或者非常低表达，从而导致CAR-T无法有效清除。CD32a表达在潜伏状态下的CD4+T细胞的表面标志物。Gp120和CD32a可能是针对HIV-1病毒活化复制和HIV-1病毒潜伏的较好的靶点。本专利技术拟进一步针对HIV复制增殖的标志物融合蛋白gp120和潜伏期的标志物胞膜蛋白CD32a为靶点，设计双靶点CAR-T细胞，彻底清除体内HIV活化复制和HIV潜伏细胞。所述的双特异性单链抗体嵌合抗原受体由CD8信号肽、HIVgp120及CD32a抗原特异性的两个单链抗体串联依次连接，再和CD28跨膜区以及CD28、CD3ζ胞内信号传导结构域依次串联组成。本专利技术针对HIV复制增殖的标志物融合蛋白gp120和潜伏期的标志物胞膜蛋白CD32a为靶点，设计双靶点CAR-T细胞，以期能彻底清除HIV感染的靶细胞，具有巨大的临床推广价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术第一目的是提供一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体，所述双特异性嵌合抗原受体中包含抗HIVgp120单链抗体和抗CD32a单链抗体。进一步地，所述双特异性嵌合型抗原受体从N端到C端顺次包括信号肽、抗HIVgp120单链抗体、StreptagⅡ、连接肽、抗CD32a单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、4-1BB、以及胞内信号刺激域CD3ζ。本专利技术的第二目的是提供双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸。进一步地，所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQIDNO：25所示。本专利技术第三目的是提供一种重组慢病毒载体，所述慢病毒载体以PTK881-EF1α载体为骨架，含有前述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸。本专利技术第四目的是提供一种免疫细胞，所述免疫细胞转染有前述的重组慢病毒载体。进一步地，所述免疫细胞为T细胞，更优选地，所述T细胞为γδT细胞。本专利技术第四目的是提供一种双特异性嵌合抗原受体编码核苷酸的构建方法。进一步地，所述构建方法包括以下步骤：1)基因合成如SEQIDNO：1所示的信号肽-抗HIVgp120单链抗体编码核苷酸SP1-N6、以及如SEQIDNO：2所示的抗CD32a单链抗体编码核苷酸MDE-8，将合成的上述编码核苷酸分别克隆至pUC57载体；2)以人cDNA文库为模板，设计引物分别扩增片段CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ、以引物互补方式得到StreptagII、G4S1短片段；3)采用OverlapPCR技术将SP1-N6、StreptagII、G4S1、MDE-8、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接，获得嵌合抗原受体的编码基因N6-MDE-8-CAR，其结构示意图如图1所示；优选地，单链抗体scFv-N6的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；scFv-N6的重链可变区VH和轻链可变区VL之间用G4S3连接，G4S3的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQIDNO.23、SEQIDNO.24所示。单链抗体scFv-MDE-8的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；单链抗体ScFv-N6、ScFv-MDE-8的氨基酸序列分别如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8；单链抗体scFv-MDE-8的重链可变区VH与轻链可变区VL之间用G4S3连接，G4S3的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQIDNO.23、SEQIDNO.24所示。更优选地，信号肽SP1的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10所示；StreptagⅡ的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQIDNO.11、SEQIDNO.12所示；G4S-Linker的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQIDNO.21、SEQIDNO.22所示；CD8铰链区的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQIDNO.13、SEQIDNO.14所示；CD28跨膜结构域的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQIDNO.15、SEQIDNO.16所示；4-1BB的核苷酸序、氨基酸序列分别如SEQIDNO.17、SEQIDNO.18所示；CD3ζ的核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQIDNO.19、SEQIDNO.20所示；本专利技术第五目的是提供双特异性嵌合抗原受体、及其编码核苷酸、重组慢病毒载体、免疫细胞在制备治疗HIV感染的药物或制剂中的应用。本专利技术的有益效果在于：CD32a表达是潜伏状态下的HIV感染的CD4+T细胞的标记，针对CD32a设计CAR是免疫细胞治疗艾滋病清除潜伏期的HIV的有效方法。本专利技术针对HIV复制增殖的标志物融合蛋白gp120和潜伏期的标志物胞膜蛋白CD32a为靶点，以免疫源性很低的gamma-delta细胞制备CAR-T，用于AIDS治疗，将达到“通用型”CAR-T生产和免疫重建双重功能，并有可能改变CAR-T药品产业化途径，具有巨大的临床推广价值，为AIDS的彻底治愈提供了一种潜在的治疗途径。附图说明图1为N6-MDE-8-CAR结构示意图；图2为PTK881-EF1α-N6-MDE-8-01质粒图谱；图3为N6-MDE-8CAR-γδT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合抗原受体中包含抗HIV gp120单链抗体和抗CD32a单链抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种治疗HIV感染的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合抗原受体中包含抗HIVgp120单链抗体和抗CD32a单链抗体。


2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合型抗原受体从N端到C端顺次包括信号肽、单链抗体(scFv)、StreptagⅡ、连接肽、单链抗体(scFv)、CD8hinge、CD28TM、4-1BB、CD3ζ；优选地，所述信号肽为CD8α信号肽，更优选地，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述单链抗体可特异性识别实体肿瘤表面的特异性蛋白；优选地；所述CD8hinge氨基酸序列如SEQIDNO.14所示；优选地，所述CD28TM氨基酸序列如SEQIDNO.16所示；优选地，所述4-1BB氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；优选地，所述CD3ζ氨基酸序列如SEQIDNO.20所示。


3.根据权利要求2所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述单链抗体为抗HIVgp120单链抗体和抗CD32a单链抗体。


4.根据权利要求2所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合型抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽、抗HIVgp120单链抗体、StreptagⅡ、抗CD32a单链抗体、CD8hinge、CD28TM、4-1BB、CD3ζ。


5.权利要求1-4任一项所述双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸，其特征在于：所述双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQIDNO：25所示。


6.一种重组慢病毒载体，其特征在于：以PTK881-EF1α载体为骨架，含有权利要求5所述的编码核苷酸。


7.一种免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞转染有权利要求6所述的重组慢病毒载体，优选地，所述免疫细胞为T细胞，更优选地，所述T细胞为γδT细胞。


8.权利要求5所述编码核苷酸的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)基因合成如SEQIDNO：1所示的信号肽-抗HIVgp120单链抗体编码核苷酸SP1-N6、以及如SEQIDNO：2所示的抗CD32a单链抗体编码核苷酸MDE-8，将合成的上述编码核苷酸分别克隆至pUC57载体；

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，顾潮江，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42