本发明专利技术公开了一种靶向c‑Met且自分泌PD‑L1 scFv的嵌合抗原受体，本发明专利技术的嵌合抗原受体修饰的T细胞在自身活化的情况下，还可特异杀伤c‑Met高表达的肿瘤细胞，并自分泌PD‑L1 scFv抗体，减弱肿瘤微环境的免疫抑制作用，促进CD8+T细胞对肿瘤的杀伤作用。
【技术实现步骤摘要】
一种靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv的嵌合抗原受体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv的嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
随着肿瘤免疫学的快速发展，近年来嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(chimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy,CAR-T)为代表的肿瘤免疫治疗引起了广泛关注，有望成为肿瘤治疗的新突破。CAR-T细胞疗法是通过基因修饰使T细胞表达一种嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)，这种嵌合抗原受体是采用肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)，并将scFv区直接和共刺激分子(如CD28)及T细胞信号传导区CD3-ζ连接。因为scFv可以以MHC非限制性方式识别并结合抗原，因此CAR与相应的肿瘤抗原结合后能以MHC非限制性方式使T细胞活化并靶向结合肿瘤细胞，通过诱导细胞凋亡、裂解性杀伤等方式杀伤肿瘤细胞。目前依据CAR-T细胞胞内信号的组成可分为三代。第一代CAR的胞内区仅含有CD3ζ，形成scFv-CD3ζ结构。第一代CAR-T细胞因缺乏共刺激信号，进入机体后很快便凋亡，因此其在体内抗肿瘤活性受到了限制。第二代CAR在胞内区增加一个免疫共刺激信号分子CD28，形成scFv-CD28-CD3ζ结构，第二代CAR-T细胞的增殖和细胞因子分泌能力提高。第三代CAR则是在胞内区再增加一个免疫共刺激信号分子CD134或CD137，形成scFv-CD28-CD134-CD3ζ或scFv-CD28-CD137-CD3ζ结构，从而可以提供长时间的T细胞扩增信号，延长CAR-T细胞在体内的存活时间。目前在血液病的治疗上，CAR-T细胞疗法取得了良好的临床治疗效果，但对于实体瘤的治疗，目前仍处于研究阶段，而CAR-T细胞疗法效果不佳的重要原因就是肿瘤免疫抑制性微环境的影响，即肿瘤自身可利用肿瘤微环境营造出适合其生长的环境进而加速肿瘤进程，逃避免疫检查的效果。因此仅使用针对某一肿瘤抗原的CAR-T细胞往往效果不佳。c-Met也被称为肝细胞生长因子受体(HGFR)或酪氨酸蛋白激酶Met，研究表明在HCC患者中，c-Met表达量普遍异常升高，且抑制c-Met的活化可以抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化等多种生物学过程。此外，c-Met过表达常导致患者的预后不良。程序性死亡受体1(PD-1)是由活化的T细胞和B细胞表达的一种关键的免疫检查点受体，可以介导免疫负调控。PD-1细胞表面的糖蛋白配体PD-L1，在肝癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中高表达，与T细胞上的PD-1结合后在肿瘤微环境中产生免疫抑制性的负调控信号、下调T细胞的功能、诱导产生免疫抑制性Treg细胞，从而抑制抗肿瘤免疫应答。此外对PD-1/PD-L1相互作用的抗体抑制剂用于肿瘤治疗在临床试验阶段也取得较理想的效果。目前，FDA已批准部分PD-1/PD-L1抗体抑制剂用于治疗相关肿瘤，而我国国家药品监督局也于6月15日批准了首个PD-1抗体药物纳武利尤单抗注射液(NivolumabInjection)的进入。目前针对肿瘤抗原c-Met及同时将免疫抑制调控点整合入CAR结构，使其自分泌抗PD-L1scFv抗体从而构建而成的CAR-T细胞及细相关免疫疗法尚未有研究报道。
技术实现思路
基于此，本专利技术的研究目的在于提供一种可靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv的嵌合抗原受体，制备可靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv的嵌合抗原受体的重组慢病毒载体，在于利用所获得的慢病毒制备可靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，以及前述抗原受体、载体、T细胞的应用。本专利技术所得的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞可以特异性识别并杀伤c-Met阳性的肿瘤细胞，同时自分泌PD-L1scfv，加强了对肿瘤细胞的杀伤功能。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD8αSP—c-MetVk—c-MetVh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1Vh—PD-L1Vk—HAtag，重链、轻链片段的连接通过Linker连接，所述的嵌合抗原受体CD8αSP—c-MetVk—c-MetVh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1Vh—PD-L1Vk—HAtag的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。优选的，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞。优选的，所述病毒载体为质粒载体和/或慢病毒载体和/或逆转录病毒载体和/或腺病毒载体。一种重组慢病毒，包括如前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。优选的，所述哺乳细胞为293细胞。一种组合物，所述组合物包括如前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体和/或前述方案中任一方案所述的重组慢病毒。前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体和/或前述方案中任一方案所述的重组慢病毒或前述方案中所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。优选的，所述肿瘤疾病为肝癌、结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌。有益效果本专利技术可靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv抗体的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(简称命名为CSPCAR-T)，所述的可靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv抗体的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞可以特异识别和杀伤c-Met抗原高表达的肿瘤细胞，同时自分泌PD-L1scfv，到达肿瘤组织周围，进而对肿瘤组织的免疫负调控微环境起到有效的作用，降低了肿瘤抗原逃逸的几率，增强了杀伤了效果，而且分泌型可以克服现有CAR-T细胞疗法由于免疫抑制性信号所带来的肿瘤免疫逃避问题，更好的杀伤肿瘤细胞。附图说明图1为本专利实施方案中CAR的结构示意图；图2为本专利实施方案中CAR质粒的核酸电泳图；图3为本专利实施方案中CAR质粒的表达验证图；图4为本专利实施方案CAR质粒中分泌抗PD-L1scFv的检测；图5A～图5D为本专利实施方案CAR-T细胞的感染效率检测图；图6A～图6C为本专利实施方案CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤作用；图7A～图7F为本专利实施方案CAR-T细胞对不同靶细胞的IL-2和IFN-γ的细胞因子分泌情况。具体实施方式下面结合具体实施方式及附图详细阐述本专利技术。以下实施方式用于说明本专利技术，不用于限制本专利技术的范围。本领域技术人员在不违背本专利技术内涵的情况下可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1Vh—PD-L1 Vk—HAtag，所述的嵌合抗原受体CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1 Vh—PD-L1 Vk—HAtag的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种靶向c-Met且自分泌PD-L1scFv的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD8αSP—c-MetVk—c-MetVh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1Vh—PD-L1Vk—HAtag，所述的嵌合抗原受体CD8αSP—c-MetVk—c-MetVh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1Vh—PD-L1Vk—HAtag的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体通过将编码其的核苷酸序列转染到T细胞中表达。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞。
【专利技术属性】
技术研发人员：郭娇娇，蒋伟，杨婷婷，季国忠，冯振卿，唐奇，毛圆，常新霞，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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