一种IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白及其构造方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种IL‑15/SuIL‑15Rα‑dFc‑γ4复合体蛋白，包含SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNo.1具有90％以上同一性的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了上述IL‑15/SuIL‑15Rα‑dFc‑γ4复合体蛋白的构造方法。本发明专利技术还公开了两种表达载体。本发明专利技术还公开了一种酵母菌株。本发明专利技术还公开了上述IL‑15/SuIL‑15Rα‑dFc‑γ4复合体蛋白在制备抗病毒、抗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术还公开了上述表达载体或酵母菌株在表达IL‑15/SuIL‑15Rα‑dFc‑γ4复合体蛋白中的应用。所述复合体蛋白显著延长了IL‑15的半衰期。

【技术实现步骤摘要】
一种IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白及其构造方法、应用
本专利技术涉及蛋白质工程
，尤其涉及一种IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白及其构造方法、应用。
技术介绍
白细胞介素15(IL-15)是一种多效性的细胞因子，参与调节机体多种免疫功能，特别是在促进NK细胞、NKT细胞及记忆性CD8+T细胞的发育、增殖和活化上具有重要作用。作为通用受体γ链细胞因子家族成员(此家族包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21)，IL-15与IL-2结构相似，并且与IL-2共用受体β亚基(IL-2/IL-15Rβ)，因此与IL-2具有许多相似的生物学功能。与IL-2的顺式提呈机制不同，IL-15具有独特的反式提呈机制，可通过与其高亲和力的受体α亚基(IL-15Rα)结合，进一步与效应细胞表面的IL-2Rβ亚基和通用γ链形成复合物进而向胞内传递信号。尽管IL-2与IL-15在刺激免疫细胞增殖和活化上具有相似的作用，但在适应性免疫应答中二者之间仍存在明显的不同，IL-2还可通过活化诱导的细胞死亡(AICD)机制和维持Treg细胞的稳定从而限制免疫应答，而IL-15则对Treg细胞无明显作用，还可抑制IL-2诱导的AICD，并促进NK细胞，CD8+CD44hi的记忆性T细胞的增殖和存活，这提示IL-15在抗肿瘤、抗病毒治疗等方面可能优于IL-2。重组人IL-15(rhIL-15)的临床试验结果显示，注射rhIL-15后，病人血液中γδT细胞，CD8+T细胞和NK细胞显著增加，然而，rhIL-15效价较低，体内半衰期短，并且在高剂量注射时具有一定的毒性反应，限制了其在临床上的应用。为了克服以上缺点，研究人员基于IL-15的生理特性，相继开发了多种IL-15复合物，例如在2006年由ErwanMortier等人开发的将IL-15与IL-15Rα的sushi结构域连接形成的复合体RLI，2008年由SigridDubois等人开发了由IL-15和二聚化的IL-15Rα-IgG1-Fc构成的复合物(IL-15/IL-15Rα-IgG1-Fc)，2011年AltorBioScience公司的研究人员研发了由IL-15N72D(一种IL-15的突变形式)分子与二聚化的IL-15Rα(sushi结构域)-IgG1-Fc构成的复合物ALT-803(现更名为N-803)。上述几种类型的IL-15复合物相较于单纯的IL-15分子均展现了更优的生物活性及延长的半衰期，已有多项研究进入临床试验并取得令人欣喜的结果，这表明IL-15在抗肿瘤、抗病毒治疗方面具有很大的开发潜力。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白及其构造方法、应用，本专利技术构建了基于巴斯德毕赤酵母的IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白，显著延长了IL-15的血浆半衰期。本专利技术提出的一种IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白，包含SEQIDNo.1所示的氨基酸序列或者与SEQIDNo.1具有90％以上同一性的氨基酸序列。上述如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提出了上述IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白的构造方法，包括如下步骤：S1、将人IL-15突变得到核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的IL-15变体；S2、将人IgG4的铰链区和Fc片段突变得到核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的IgG4Fc变体；S3、将IgG4Fc变体与IL-15Rα的sushi结构域通过IgG4Fc变体中的铰链区连接得到SuIL-15Rα-dFc-γ4，其中，SuIL-15Rα-dFc-γ4的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；S4、将IL-15变体与SuIL-15Rα-dFc-γ4共表达得到IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白。上述IL-15变体的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，IgG4Fc变体的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，SuIL-15Rα-dFc-γ4的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示。上述对人IL-15、人IgG4的铰链区和Fc片段进行的突变，按照本领域常规突变方法进行。上述IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白的结构、其构造方法的示意图，参见图1，图1为IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白的表达载体构建示意图和结构示意图，其中，A为表达载体构建示意图；B为结构示意图。图1A中表达载体pPIC9-SuIL-15Rα-dFc-γ4和表达载体pPICZα-IL-15分别利用其载体上的HIS4序列和5’AOX1序列，以同源重组的方式先后插入到毕赤酵母GS115菌株基因组中的相应位点，从而构建出能表达IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白的毕赤酵母菌株。本专利技术还提出了一种表达载体，包含5’AOX1启动子、转录终止子、抗生素抗性基因和分泌信号肽，还包含上述IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白的构造方法中IL-15变体的核苷酸序列。本专利技术还提出了一种表达载体，包含5’AOX1启动子、转录终止子、抗生素抗性基因和分泌信号肽，还包含上述IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白的构造方法中SuIL-15Rα-dFc-γ4的核苷酸序列。本专利技术还提出了一种酵母菌株，所述酵母菌株包含上述两种表达载体。优选地，酵母菌株为毕赤酵母菌株。本专利技术还提出了一种上述IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白在制备抗病毒、抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提出了一种上述表达载体或上述酵母菌株在表达IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白中的应用。本专利技术人经过长期的融合蛋白研究积累，构建了基于巴斯德毕赤酵母的IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白，显著延长了IL-15的半衰期；本专利技术对IL-15进行突变，将IL-15氨基酸序列上的第72位天冬酰胺突变为天冬氨酸，以提高IL-15的生物活性，将第71位、第79位、第112位的天冬酰胺均突变为谷氨酰胺，以降低潜在的糖基化修饰可能带来的免疫原性得到IL-15变体；对人IgG4的Fc片段进行突变，将Fc片段氨基酸序列上的第235位亮氨酸突变为谷氨酸，将第297位天冬酰胺突变为谷氨酰胺，以降低如抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应(ADCC)和补体依赖的细胞毒效应(CDC)，并对人IgG4的铰链区进行突变，将氨基酸序列上的第228位丝氨酸突变为脯氨酸，以阻止半抗体分子的形成并使得抗体分子内二硫键正确配对，稳定链内二硫键得到IgG4Fc变体；然后将IgG4Fc变体与IL-15Rα的sushi结构域通过IgG4Fc变体中的铰链区连接得到SuIL-15Rα-dFc-γ4，其中dFc为双链Fc，最后采用巴斯德本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白，其特征在于，包含SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNo.1具有90％以上同一性的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白，其特征在于，包含SEQIDNo.1所示的氨基酸序列或者与SEQIDNo.1具有90％以上同一性的氨基酸序列。


2.一种如权利要求1所述IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白的构造方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将人IL-15突变得到核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的IL-15变体；
S2、将人IgG4的铰链区和Fc片段突变得到核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的IgG4Fc变体；
S3、将IgG4Fc变体与IL-15Rα的sushi结构域通过IgG4Fc变体中的铰链区连接得到SuIL-15Rα-dFc-γ4，其中，SuIL-15Rα-dFc-γ4的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；
S4、将IL-15变体与SuIL-15Rα-dFc-γ4共表达得到IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白。


3.一种表达载体，包含5’AOX1启动子、转录终...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖卫华，徐欢，郭雨刚，邬婧，邵长胜，李浩，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34